[發(fā)明專利]抗重茬修復(fù)三七連作土壤生態(tài)菌劑的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310020577.4
• 申請日: 2013-01-21
• 公開（公告）號: CN103045582A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張清敏;唐景春;張彥峰;王發(fā)云;王麟猛;趙穎;張瑩捷
• 申請（專利權(quán)）人: 南開大學(xué);文山市盛大中藥材專業(yè)合作社;昆明天泰昌生物科技有限公司
• 主分類號: C12N11/14
• 分類號: C12N11/14;C09K17/14;C12R1/125;C12R1/10;C12R1/12;C12R1/46;C12R1/74;C12R1/79;C12R1/465;C09K101/00
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所屬技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵，特別是指一種能夠抗重茬修復(fù)三七連作土壤生態(tài)菌劑的制備方法。

背景技術(shù)

在三七大量種植的今天，由于大量使用化肥、農(nóng)藥，使得土壤-微生物-三七根形成的土壤生態(tài)系統(tǒng)受到嚴(yán)重破壞，有益菌受到抑制，而致病的真菌，如銹腐病菌、惡疫霉、腐皮鐮孢菌、立枯絲核菌和腐霉菌等，得到擴散生長，致使三七頻繁發(fā)生重茬病，如根腐、枯萎、黃苗、花葉、黑斑等，使得新開墾的森林土在種植3-5年(一茬)三七后，不能再重復(fù)利用，一般需要經(jīng)過十年甚至十幾年以上的自然修復(fù)才能再種植三七。因此，能種植三七的土地越來越少。對三七重茬病的傳統(tǒng)防治方法有化學(xué)防治和種植措施防治。近年來，由于傳統(tǒng)的種植措施防治方法不能從根本上控制病害的發(fā)生，防治效果甚微；而長期使用化學(xué)農(nóng)藥會使病原菌產(chǎn)生抗藥性，過量使用農(nóng)藥也會破壞土壤的微生態(tài)環(huán)境，加重農(nóng)藥對環(huán)境的污染，造成有害有毒物質(zhì)在作物體內(nèi)殘留過高的惡果。采用微生物菌劑防治方法研究越來越受到人們的重視。從修復(fù)土壤生態(tài)系統(tǒng)入手，增加土壤中的有益菌，從而抑制那些容易感染植株病害的細(xì)菌和真菌。采用細(xì)菌-真菌聯(lián)合、多菌種聯(lián)合的技術(shù)方法，達(dá)到修復(fù)土壤生態(tài)系統(tǒng)，防止根腐病、枯萎病等重茬病發(fā)生，同時促進(jìn)根生長，松土壯苗。益根生菌劑還具有降解農(nóng)藥、化肥殘留污染的作用。菌劑經(jīng)發(fā)酵工程完成后有效活菌數(shù)(cfu)在20億以上，即2-3×10⁹cfu/g。

采用細(xì)菌-真菌聯(lián)合預(yù)防三七重茬病益根生菌菌劑及其高密度、高活性的生產(chǎn)工藝還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于提供一種高密度、高活性的預(yù)防三七重茬病益生菌菌劑制備方法。

本發(fā)明的技術(shù)設(shè)計構(gòu)思是：

抗重茬益生菌菌劑的制備方法，包括發(fā)酵步驟，是將菌劑生產(chǎn)的一級種子液接種于以玉米粉-馬鈴薯-豆粕為主成分的培養(yǎng)基中進(jìn)行二級、三級發(fā)酵，所述的發(fā)酵過程是在溫度為30℃、pH值為7.2-7.6的條件下進(jìn)行的好氧發(fā)酵，生產(chǎn)菌種選用枯草芽孢桿菌CGMCC1.1630(Bacillus?subtilis)，地衣芽孢桿菌CGMCC1.518(Bacillus?1icheniformis)，多粘芽孢桿菌CGMCC1.516(Paenibacillus?polymyxa)，糞鏈球菌CGMCC1.101(Streptococcus?feaculis)，熱帶假絲酵母CGMCC2.1773(Candida?tropicalis)，淡紫擬青霉CGMCC3.4034(Paecilomyces?lilacinus)，細(xì)黃鏈霉菌CGMCC4.399(Streptomyces?microflavus)等7株細(xì)菌-真菌。將發(fā)酵終產(chǎn)物吸附、固定化于用草炭生物炭上，制成的固體粉末菌劑。

本發(fā)明中所用菌種均購于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。無毒、無害，對土壤環(huán)境友好。用這些菌去修復(fù)遭到破壞的土壤生態(tài)系統(tǒng)，與原土壤的有益菌共同形成新的生態(tài)平衡。

所述的擴大培養(yǎng)發(fā)酵過程包括下列工藝步驟：(1)、將保存的各斜面菌種先用平板劃線法活化后，挑取單菌落，分別經(jīng)試管(約10mL)、小三角瓶(100-150mL)到大三角瓶(1000-1500mL)逐級擴大培養(yǎng)制成一級種子液(每株菌各1000-1500mL)；一級種子液的制備過程：枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，多粘芽孢桿菌，糞鏈球菌和細(xì)黃鏈霉菌的培養(yǎng)基采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，pH值7.2-7.6，水1000mL)；熱帶假絲酵母和淡紫擬青霉采用馬鈴薯-蔗糖培養(yǎng)基(去皮馬鈴薯200g水煮20-30min，雙層紗布過濾去渣留液，蔗糖20g，用水補足1000mL，自然pH值)。

培養(yǎng)條件：溫度為28-30℃，時間為24-48h.

(2)、將(1)步驟中制備的一級種子液進(jìn)行等質(zhì)量混合，轉(zhuǎn)接于二級擴大培養(yǎng)液(30-35L)，(培養(yǎng)基組成：玉米粉30g，去皮馬鈴薯20g，豆粕2g，蔗糖2g，硝酸鉀1.0g，磷酸氫二鉀0.5g，硫酸鎂0.5g，氯化鈉0.5g，硫酸亞鐵0.001g，蒸餾水1000mL，用過飽和氫氧化鈣調(diào)節(jié)pH值7.2-7.6)。以5％-10％的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行混合好氧發(fā)酵，溫度30℃，攪拌轉(zhuǎn)速150-200r/min，通氣壓力保持0.05Mpa，發(fā)酵培養(yǎng)20-24h，制備成二級種子液；