[發明專利]星蟲重組鐵結合蛋白及制備方法

無效

• 申請號: 201310018467.4
• 申請日: 2013-01-18
• 公開（公告）號: CN103102405A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 蘇秀榕;周君;李曄;張春丹;李成華;劉艷;張云云
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C12N15/70;C07K1/32
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務所(普通合伙) 33226
• 代理人: 程曉明

技術領域

?本發明涉及鐵結合蛋白，具體涉及星蟲重組鐵結合蛋白及星蟲的體外重組鐵結合蛋白的制備方法。

背景技術

鐵結合蛋白（鐵蛋白）是一種具有儲存數千鐵離子及數百磷分子能力的蛋白質，其分子結構被認為是由高度對稱性亞基所組合的蛋白質，外殼可以包裹著由鐵磷化合物組成的鐵核。鐵核結構起著供給和存儲鐵的“倉庫作用”，鐵蛋白的蛋白殼上含有兩種橫跨蛋白殼的隧道，即三相(X.Y.Z)物質交換隧道和電子隧道，前者的作用供無機磷鐵及其他小分子進出，后者的功能起著接收及傳遞電子的作用。脊椎動物的鐵蛋白由兩種不同類型的亞基組成，即H和L亞基，L型亞基與H型亞基相互作用使氧化型鐵礦化為一個鐵核。。目前大部份是脊椎動物的重組鐵蛋白，如申請號為CN為200510048963.X的發明專利申請就公開了利用基因工程技術，通過人乳鐵蛋白基因的克隆、重組桿狀病毒的構建、家蠶體內表達和人乳鐵蛋白純化得到重組人乳鐵蛋白。也有無脊椎動物的重組鐵蛋白，如公開號為CN102051363的發明專利申請，則公開了文蛤鐵蛋白基因、編碼蛋白、體外重組產物等，通過文蛤RNA提取和純化、cDNA構建及鐵蛋白基因的篩選、RACE獲得鐵蛋白基因序列，再利用鐵蛋白基因進行PCR擴增、克隆至表達載體、轉化至大腸桿菌、LB培養劑培養、菌體用雞蛋清溶菌酶處理、超聲破碎、從包涵體體中純化得到目的蛋白。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種星蟲重組鐵結合蛋白及星蟲的體外重組鐵結合蛋白的制備方法，該重組星蟲鐵結合蛋白具有存儲鐵功能外，還具有富集重金屬和有機磷的功能。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：星蟲重組鐵結合蛋白，該星蟲重組鐵結合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ?ID?NO.1所示。

星蟲的體外重組鐵結合蛋白的制備方法，其步驟如下：

a、?RNA提取：取星蟲體壁80-100mg速凍于液氮中，研磨成粉，用RNAiso?plus

提取試劑盒提取得到星蟲RNA，具體提取方法依照提取試劑盒說明書進行操作；?

b、cDNA合成：將星蟲RNA用cDNA試劑盒合成cDNA，具體合成方法依該cDNA試劑盒說明操作，得到cDNA文庫質粒，然后用下述引物對合成的cDNA進行PCR擴增，上游引物：5’-TTGTTCTGTC?AGGAAGTGGC-3’，?下游引物：5’-CTAACAGGAC?TGGTTGACG-3’；?PCR擴增體系：cDNA文庫質粒：1.0μL，10×PCR?緩沖液：2.5μL，MgCl₂（25mM）：2.0μL，dNTP（10mM）：2.0μL，上游引物（10μM）：1.0μL，下游引物（10μM）：1.0μL，DNA聚合酶（5U/μL）：0.2μL，超純水：15.3μL，總體積：25.0μL。擴增條件：94℃?5?min、94℃?30?s、58℃?3?s0、72℃?1min?，共35個循環，最后72℃延伸10?min；擴增反應后，用回收試劑盒回收電泳后的PCR產物，然后PCR產物與載體pMD18-T連接，轉化至大腸桿菌E.Coli?DH5α后，在含有氨芐濃度為80-100mg/L的LB平板培養基中培養8-12h，挑取陽性克隆菌落，得到陽性克隆質粒；陽性克隆質粒測序后用BLAST軟件進行比對，確定質粒含有星蟲鐵結合蛋白基因；?