[發明專利]星蟲重組鐵結合蛋白及制備方法

無效

• 申請號: 201310018467.4
• 申請日: 2013-01-18
• 公開（公告）號: CN103102405A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 蘇秀榕;周君;李曄;張春丹;李成華;劉艷;張云云
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C12N15/70;C07K1/32
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務所(普通合伙) 33226
• 代理人: 程曉明

1.星蟲重組鐵結合蛋白，其特征在于該星蟲重組鐵結合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ?ID?NO.1所示。

2.權利要求1所述的星蟲重組鐵結合蛋白的制備方法，其特征在于步驟如下：

a、?RNA提取：取星蟲體壁80-100mg速凍于液氮中，研磨成粉，用RNAiso?plus提取試劑盒提取得到星蟲RNA，具體提取方法依照提取試劑盒說明書進行操作；

????b、cDNA合成：將星蟲RNA用cDNA試劑盒合成cDNA，具體合成方法依cDNA試劑盒說明書操作，得到cDNA文庫質粒，然后用下述引物對合成的cDNA進行PCR擴增，上游引物的核苷酸序列為TTGTTCTGTC?AGGAAGTGGC，?下游引物的核苷酸序列為CTAACAGGAC?TGGTTGACG；?PCR擴增體系：cDNA文庫質粒1.0μL，10×PCR?緩沖液2.5μL，濃度25mM的?MgCl₂2.0μL，濃度10mM的?dNTP2.0μL，濃度10μM的上游引物1.0μL，濃度10μM的下游引物1.0μL，濃度5U/μL的?DNA聚合酶0.2μL，超純水：15.3μL；擴增條件：94℃?5?min、94℃?30?s、58℃?3?s0、72℃?1min?，共35個循環，最后72℃延伸10?min；擴增反應后，用回收試劑盒回收PCR產物，然后PCR產物與載體pMD18-T連接，轉化至大腸桿菌E.Coli?DH5α后，在含有氨芐濃度為80-100mg/L的LB平板培養基中培養8-12h，挑取陽性克隆菌落，得到陽性克隆質粒；

c、重組質粒：對上述陽性克隆質粒進行PCR擴增，擴增體系：上述陽性克隆質粒1.0μL，10×PCR?緩沖液2.5μL，濃度25mM?的MgCl₂1.5μL，濃度10mM的?dNTP2.5μL，濃度10μM的正向引物1.0μL，濃度10μM的反向引物1.0μL，?濃度5U/μL的?DNA聚合酶0.2μL，超純水15.3μL；擴增條件：94℃?4?min、94℃?1min、58℃?1min、72℃?1min?，共35個循環，最后72℃延伸10?min；其中正向引物的核苷酸序列為GCGGGATCCA?TGTCTCTGTC?AAGACCA，反向引物序列為GCGAAGCTTG?TTTAGCTGTC?G?CCATCG，擴增產物經QIAquick?Gel?Extraction純化試劑盒純化后，再用BamHⅠ和Hind?Ⅲ內切酶酶切，酶切產物與載體pET-28a(+)連接，獲得重組質粒，重組質粒轉化至E.Coli?BL21(DE3)中，再接種到卡那霉素濃度為50μg/mL的?LB培養液中，37℃、120r/min振蕩培養至菌液A600值為0.6~0.8時，加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷使其終濃度為1mmol/L，37℃誘導表達3-6h，收集菌液經12000r/min離心5min，棄上清液，得到細菌沉淀物，4℃保存；

d、蛋白純化：細菌沉淀物用1×磷酸緩沖液漂洗，再在4℃、12000?r/min離心5min，得漂洗后細菌沉淀物，每克漂洗后的細菌沉淀物中加入5ml的1×磷酸緩沖液，混勻后4℃下，用450W超聲波，超聲破碎10min，?12000?r/min離心5min得到包涵體沉淀；每克包涵體沉淀加入200μL?緩沖液B，0.5μLβ-巰基乙醇和4μL濃度為20mM的咪唑，輕微混勻后，在室溫放置1h，?12000?r/min離心10min保留上清液，在每毫升上清液中加入鎳珠10μL，輕微混勻30min，12000?r/min離心10s，去上清得到鎳珠-鐵合結蛋白沉淀，10毫克鎳珠-鐵合結蛋白沉淀中加入250μL緩沖液C和5μL濃度為20mM的咪唑，輕微混勻后，12000?r/min離心10s，去上清，在2-5毫克沉淀中加入25μL?緩沖液E和5μL濃度為160mM的咪唑，輕微混勻后，12000?r/min離心10s，取上清，得到含重組鐵結合蛋白的洗脫液，濃縮洗脫液得到如序列表SEQ?ID?NO.1所示的星蟲重組鐵結合蛋白；所述緩沖液B的pH為8.0，所述緩沖液B含有濃度為100mM的?NaH₂PO₄，濃度為10mM的三羥甲基氨基甲烷，濃度為?6M的鹽酸胍；所述緩沖液C的pH為6.3，所述緩沖液C含有濃度為100mM?的NaH₂PO₄，濃度為10mM的三羥甲基氨基甲烷，濃度為8M的尿素；所述緩沖液E的pH為4.5，所述緩沖液E含有濃度為100mM的?NaH₂PO₄，濃度為10mM的三羥甲基氨基甲烷，濃度為8M?的尿素。