[發明專利]檢測轉基因水稻品系科豐8號的引物和探針、試劑盒和方法

無效

• 申請號: 201310018200.5
• 申請日: 2013-01-17
• 公開（公告）號: CN103060459A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 黃文勝;陳穎;鄧婷婷;付凱
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 隆天國際知識產權代理有限公司 72003
• 代理人: 任曉華;吳小瑛

技術領域

本發明屬于生物技術領域。更具體地，本發明涉及用于通過實時PCR法檢測轉基因水稻品系科豐8號或其組分的引物和探針，包含所述引物和探針的試劑盒，以及利用所述引物和探針檢測轉基因水稻品系科豐8號成分或其組分的實時PCR檢測方法。

背景技術

轉基因生物是指利用生物技術，將外源基因轉移到其它物種中以改造其遺傳特性，從而獲得人類所需的性狀、營養品質而產生的生物新品種。以轉基因生物或以其為原料加工而來的食品農產品就是轉基因食品農產品。從1994年第一例轉基因食品農產品(轉基因番茄)在美國誕生至今，轉基因生物已廣泛進入食品飼料領域。

轉基因抗蟲水稻的培育

水稻(Oryza?sativa?L.)是中國最大宗糧食作物，年產量在2億噸左右，約占中國糧食總產量的40％。水稻生產中的主要害蟲為鱗翅目害蟲，主要包括二化螟(Chilo?suppressalis)、三化螟(Tryporyza?incertulas)、稻縱卷葉螟(Chaphalocrocis?medina)和大螟(Sesamia?inferens)，以及屬于同翅目害蟲的褐飛虱(Milaparvata?lugens，Stal)、白背飛虱(Sogatella?furcifera，Horv6th)等，嚴重影響中國大米生產。培育轉基因抗蟲水稻是防治的有效途徑。

蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白(Bacillus?thringiensis?insecticidal?crystalprotein；Bt蛋白)，是蘇云金桿菌芽孢形成過程中產生的伴胞晶體，該蛋白對鱗翅目和部分鞘翅目昆蟲具高度特異的殺蟲活性，在靶昆蟲堿性腸道內溶解并經中腸蛋白酶的消化后，成為具有活性的毒性肽，與昆蟲中腸的膜受體特異結合，形成跨膜離子通道，破壞消化道細胞的滲透壓，最終致死昆蟲。由于Bt蛋白在哺乳動物中無結合位點，且在人體內可被快速消化，因此對人和家畜無毒，在有機農業中已使用了50多年。

豇豆胰蛋白酶抑制劑基因(Cowpea?trypsin?inhibitor，CpTI)是另一類常用的抗蟲基因。在自然界CpTI主要存在于豇豆種子中，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族，被害蟲攝食后，CpT能抑制其腸道內胰蛋白酶的活性，同時產生厭食反饋信號，致使害蟲進食減少，最終抑制其生長發育。

中科院遺傳所與福建農科院等將密碼子優化的Cry1Ac基因和CpTI基因轉入水稻品種明恢86中，經自交選育獲得轉基因自交系科豐8號，經農業部批準進行了中間試驗、環境釋放和生產性試驗，有望在不久的將來在農業生產上應用。

轉基因食品的管理要求

已完成的安全試驗和環境釋放試驗結果顯示，轉基因水稻具有食用安全和生態安全、抗蟲效果優良等特點。作為食品或飼料，轉基因作物與常規品種沒有實質差別。但轉基因食品農產品作為一種新技術產品，消費者仍憂慮其安全性。

世界上主要國家立法對轉基因產品進行管理，美加、歐盟、日本、韓國、澳新的法律明確規定，轉基因動植物品種需經政府批準，并經嚴格的生物安全、環境安全測試才可以田間種植、環境釋放及作為食品、飼料，歐盟、日本、韓國、澳新等要求轉基因食品進行標識，并規定了相應閾值水平。中國于2001年5月23日頒布《農業轉基因生物安全管理條例》也有相應的安全管理規定。2002年3月20日開始實行的《農業轉基因生物標識管理辦法》也規定了轉基因食品、農產品的標識制度。轉基因產品檢測是執法的關鍵措施之一，需要通過定性檢測確定轉基因的種類，鑒別其是否為已批準的或已獲準用于食品、飼料、農產品，以防止具有風險的未知轉基因產品的任意擴散，對社會產生危害；還需要通過定量檢測確定轉基因產品的含量，明確是否已達到所在國家規定的閾值水平，因為每個國家轉基因標識的閾值水平都不相同。

轉基因食品的檢測方法

與蛋白表達具有組織特異性相比，核酸檢測不受到材料種類的限制，且核酸比蛋白穩定，在加工食品、飼料、農產品中仍可檢出，因此，食品、飼料、農產品的轉基因檢測中主要檢測轉基因核酸。

當外源基因插入到受體細胞染色體時，同時攜有啟動子、終止子、選擇標記基因和報告基因，如花椰菜花葉病毒(CaMV)35s啟動子，胭脂堿合酶NOS終止子等，核酸檢測的靶標是插入的外源基因，包括外源基因的整合位點、啟動子、終止子、選擇基因的序列。

核酸的檢測方法包括常規PCR方法和實時PCR方法(Real-time?PCR)，其中，實時熒光定量PCR是在常規PCR方法的基礎上建立起來的。