[發明專利]可同時檢測哈維氏弧菌和鰻弧菌的雙重PCR方法

無效

• 申請號: 201310018027.9
• 申請日: 2013-01-18
• 公開（公告）號: CN103088132A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發明（設計）人: 李華;李強;馮春明;葉仕根;王軼南
• 申請（專利權）人: 大連海洋大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 大連非凡專利事務所 21220
• 代理人: 閃紅霞

技術領域

本發明涉及一種雙重PCR檢測方法，尤其是一種耗時短、效率高、靈敏度高，可直接應用于臨床的可同時檢測哈維氏弧菌和鰻弧菌的雙重PCR方法。

背景技術

弧菌廣泛分布于近岸、河口海區，大多是存在于海水和海洋生物體表及腸道的優勢菌群，同時也是引起海水養殖動物細菌性疾病的最重要的病原菌之一。大量的研究和生產實踐表明，弧菌病就是由弧菌屬細菌引起的一類細菌性疾病。

鰻弧菌(Vibrio.?anguillarum)和哈維氏弧菌(Vibrio.harveyi)是兩種重要的水產動物弧菌病病原菌，流行廣、發病率高。鰻弧菌是條件性致病菌，當養殖動物在不良的環境條件下，遭遇不利刺激或是受傷時，會誘發疾病的發生，可感染至少40多種魚，如虹鱒、鰻鱺、香魚、鱸魚、大菱鲆、牙鲆、黃魚等。感染鰻弧菌的魚蝦病情會逐步加深，如感染鰻弧菌的魚體表最初出現局部褪色，鰭條、鰭基部及鰓骨下部充血發紅，肛門紅腫，繼而肌肉組織有彌散性或點狀出血，體表發黑，鰭部出現潰爛。解剖檢驗時有明顯的黃色粘稠腹水，腸粘膜組織腐爛脫落，部分魚肝臟壞死。哈維氏弧菌能引起大黃魚、石斑魚、鯛、尖吻鱸、斜帶石斑魚、高體螄、大菱鲆、文蛤、對蝦等多種水產動物的疾病，如感染哈維氏弧菌后的大黃魚體表發白，游動遲緩，經常浮出水面離群獨游，體表多處皮膚潰爛，傷口周圍鱗片松散脫落，胸、腹部有彌散性出血，尾鰭基部充血，尾部嚴重潰爛。哈維氏弧菌給養殖戶造成嚴重的損失，而且還能通過食物鏈引起食用者中毒，是人魚共患病原菌。因此，在水產養殖生產中建立對弧菌病的早期檢測技術，是有效預防弧菌病的重要手段。

目前，雙重PCR主要應用于可引起人類疾病的弧菌檢測，如食品檢測等，而在水產動物弧菌病基本上都是沿用普通PCR方法，一次只能檢測一種弧菌，檢測所需時間長且常常造成漏檢或誤檢。

發明內容

本發明是為了解決現有技術所存在上述問題，提供一種耗時短、效率高、靈敏度高，可直接應用于臨床的可同時檢測哈維氏弧菌和鰻弧菌的雙重PCR方法。

本發明的技術解決方案是：一種可同時檢測哈維氏弧菌和鰻弧菌的雙重PCR方法，其特征在于依次按如下步驟進行：

a.?制備被檢測物的DNA模板并置于反應管中；

b.?將鰻弧菌引物和哈維氏弧菌引物放入a步驟的反應管中進行雙重PCR?反應，所述鰻弧菌引物的濃度為1-20?pmol/μl，所述哈維氏弧菌引物的濃度為1-20?pmol/μl；

所述鰻弧菌引物引物序列為：

Rpo-F:5’-?AGACCAAGAGATCATGGATT?-3’

Rpo?-R:?5’-?AGTTGTTCGTATCTGGGATG-3’

所述哈維氏弧菌引物序列為：

Tox-F:?5’-?GAAGCAGCACTCACCGAT?-3’

Tox-R:?5’-?GGTGAAGACTCATCAGCA?-3’

所述雙重PCR?反應條件為：94℃預變性3min；94℃?30s，52.0-61℃?30s，72℃?1min，共32個循環；72℃終延伸7min；

?所述雙重PCR反應體系為25μl：1μlDNA模板，2.5μl不含Mg²⁺的10×PCR?buffer，0.5μl的10mM的dNTP，2μl的25mM的Mg²⁺，0.15μl的Taq酶（50U），引物各1μl，雙蒸水17.85μl。

所述a步驟的制備被檢測物的DNA模板是取水產動物的組織勻漿液置于1.5ml的離心管中，800g離心5min，除去組織碎片取上清置于1.5ml滅菌離心管中；10，000g離心10min，除去上清液，加入100μl?0.1?M?的TE緩沖溶液，100℃沸水浴10min；?10，000g離心10min，上清液即水產動物DNA模板。

本發明與現有普通PCR檢測哈維氏弧菌和鰻弧菌技術相比，方法簡單、耗時短、成本低廉，引物檢測靈敏度高，適于基層檢驗檢疫機構及養殖場操作，對由這兩種弧菌引起的弧菌病的監測與預防提供了有效的工具，可有效減少經濟損失。

附圖說明

圖1是本發明實施例1的PCR擴增圖。

圖2是本發明實施例2的PCR擴增圖。

圖3是本發明實施例3的PCR擴增圖。

具體實施方式

實施例1：