[發明專利]可同時檢測哈維氏弧菌和鰻弧菌的雙重PCR方法

無效

• 申請號: 201310018027.9
• 申請日: 2013-01-18
• 公開（公告）號: CN103088132A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發明（設計）人: 李華;李強;馮春明;葉仕根;王軼南
• 申請（專利權）人: 大連海洋大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 大連非凡專利事務所 21220
• 代理人: 閃紅霞

1.一種可同時檢測哈維氏弧菌和鰻弧菌的雙重PCR方法，其特征在于依次按如下步驟進行：

a.?制備被檢測物的DNA模板并置于反應管中；

b.?將鰻弧菌引物和哈維氏弧菌引物放入a步驟的反應管中進行雙重PCR?反應，所述鰻弧菌引物的濃度為1-20?pmol/μl，所述哈維氏弧菌引物的濃度為1-20?pmol/μl；

所述鰻弧菌引物引物序列為：

Rpo-F:5’-?AGACCAAGAGATCATGGATT?-3’

Rpo?-R:?5’-?AGTTGTTCGTATCTGGGATG-3’

所述哈維氏弧菌引物序列為：

Tox-F:?5’-?GAAGCAGCACTCACCGAT?-3’

Tox-R:?5’-?GGTGAAGACTCATCAGCA?-3’

所述雙重PCR?反應條件為：94℃預變性3min；94℃?30s，52.0-61℃?30s，72℃?1min，共32個循環；72℃終延伸7min；

?所述雙重PCR反應體系為25μl：1μlDNA模板，2.5μl不含Mg²⁺的10×PCR?buffer，0.5μl的10mM的dNTP，2μl的25mM的Mg²⁺，0.15μl的Taq酶（50U），引物各1μl，雙蒸水17.85μl。

2.根據權利要求1所述的可同時檢測哈維氏弧菌和鰻弧菌的雙重PCR方法，其特征在于：所述a步驟的制備被檢測物的DNA模板是取水產動物的組織勻漿液置于1.5ml的離心管中，800g離心5min，除去組織碎片取上清置于1.5ml滅菌離心管中；10，000g離心10min，除去上清液，加入100μl?0.1?M?的TE緩沖溶液，100℃沸水浴10min；?10，000g離心10min，上清液即水產動物DNA模板。