[發(fā)明專利]一種用于細(xì)胞培養(yǎng)的多糖/Matrigel復(fù)合凝膠膜及其制備方法和應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2013-01-17
• 公開（公告）號: CN103113627A
• 公開（公告）日: 2013-05-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李萌
• 申請（專利權(quán)）人: 黑龍江省重生生物科技有限公司
• 主分類號: C08L5/04
• 分類號: C08L5/04;C08L5/06;C08L5/08;C08L89/00;C08K3/16;C08J3/075;C12N5/071
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;費(fèi)碧華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于細(xì)胞培養(yǎng)的多糖/Matrigel復(fù)合凝膠膜及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

細(xì)胞擴(kuò)增是細(xì)胞治療和組織工程發(fā)展的必要前提，近年來發(fā)展的多種規(guī)模化培養(yǎng)貼壁細(xì)胞的新措施，已經(jīng)在工程細(xì)胞系等大規(guī)模培養(yǎng)中廣泛應(yīng)用，即通過模擬細(xì)胞在體內(nèi)的生長微環(huán)境與增殖活動，控制其擴(kuò)增與定向分化是培養(yǎng)細(xì)胞的基本出發(fā)點(diǎn)。目前多用具有良好生物相容性材料來模擬細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞的體外擴(kuò)增，主要包括透明質(zhì)酸、膠原、殼聚糖、海藻酸鹽、明膠等。近年來，Matrigel由于其獨(dú)特的性能在細(xì)胞培養(yǎng)中受到越來越多的關(guān)注，Matrigel在EHS小鼠腫瘤中分離出，主要包含層粘連蛋白、Ⅳ型膠原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白等組成，還包含有一些微量的生長因子、表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β、纖維細(xì)胞生長因子等。適用于作為多種細(xì)胞的培養(yǎng)基底，構(gòu)建多種組織。但是其價(jià)格昂貴，同時(shí)其操作不方便，使其在細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)上的大規(guī)模應(yīng)用受到了一定的限制。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種用于細(xì)胞培養(yǎng)的多糖/Matrigel復(fù)合凝膠膜及其制備方法，以該方法制得的復(fù)合凝膠膜含有具有生物相容性的多糖以及Matrigel，可模擬體內(nèi)細(xì)胞基底膜的結(jié)構(gòu)、組成、物理特性和功能，能夠促進(jìn)多種細(xì)胞的增殖。

本發(fā)明通過下述技術(shù)方案加以實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明的一種用于細(xì)胞培養(yǎng)的多糖/Matrigel復(fù)合凝膠膜，其特征在于以多糖和Matrigel為原料，采用鈣離子作為交聯(lián)劑，通過留延法（也稱“流延法”）制備。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的多糖為海藻酸鹽、果膠、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素中一種或多種多糖的組合。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的多糖/Matrigel復(fù)合凝膠膜是通過以下方法制備得到：

(1)稱取一定量多糖，將其溶于去離子水中，制備成質(zhì)量百分比濃度為0.1%-3%多糖溶液，攪拌直至全部溶解，備用；

(2)配制0.1M的氯化鈣溶液，過濾滅菌，備用；

(3)取一定體積的Matrigel溶液（自制或購自BD公司，貨號：354234），在其中加入一定量的去離子水形成蛋白濃度為9-15mg/ml的Matrigel溶液，整個操作過程需在冰上操作；

(4)在超凈工作臺中量取步驟(1)制備的溶液5ml，在其中加入步驟(3)制備的Matrigel溶液0.1-8ml，加入0.5-5ml步驟(2)配制的氯化鈣溶液，混合攪拌，然后將其倒入細(xì)胞培養(yǎng)器皿或細(xì)胞培養(yǎng)板中，以上過程需在冰上操作，然后將其置于37℃培養(yǎng)箱中孵育2-5min，形成用于細(xì)胞培養(yǎng)的復(fù)合凝膠膜。

9mg/ml的蛋白濃度（膠濃度）是Matrigel在特定溫度下（22-35℃）自己形成凝膠的最低濃度，本發(fā)明中形成凝膠通過兩種方式：

（1）依靠多糖與交聯(lián)劑（氯化鈣）發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而形成，在復(fù)合膜中matrigel含量比較低時(shí)，主要通過與多糖交聯(lián)形成凝膠，Matrigel可與多糖形成半互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)而形成復(fù)合凝膠；

（2）當(dāng)Matrigel濃度達(dá)到9mg/ml或以上時(shí)則與多糖共同形成雙網(wǎng)絡(luò)凝膠。

進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了一種制備所述的用于細(xì)胞培養(yǎng)的多糖/Matrigel復(fù)合凝膠膜的方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)稱取一定量多糖，將其溶于去離子水中，制備成質(zhì)量百分比濃度為0.1%-3%多糖溶液，攪拌直至全部溶解，備用；

(2)配制0.1M的氯化鈣溶液，過濾滅菌，備用；

(3)取一定體積的Matrigel溶液（自制或購自BD公司，貨號：354234），在其中加入一定量的去離子水形成蛋白濃度為9-15mg/ml的Matrigel溶液，整個操作過程需在冰上操作；

(4)在超凈工作臺中量取步驟(1)制備的溶液5ml，在其中加入步驟(3)制備的Matrigel溶液0.1-8ml，加入0.5-5ml步驟(2)配制的氯化鈣溶液，混合攪拌，然后將其倒入細(xì)胞培養(yǎng)器皿或細(xì)胞培養(yǎng)板中，以上過程需在冰上操作，然后將其置于37℃培養(yǎng)箱中孵育2-5min，形成用于細(xì)胞培養(yǎng)的復(fù)合凝膠膜。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的多糖為海藻酸鹽、果膠、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素中一種或多種多糖的組合。

該方法過程簡單且通過該方法制備的復(fù)合凝膠膜，能夠促進(jìn)多種細(xì)胞的增殖，同時(shí)該復(fù)合凝膠膜具有良好的力學(xué)性能，可適合細(xì)胞的長期培養(yǎng)，并且可以根據(jù)細(xì)胞類型選擇不同的Matrigel含量來調(diào)控基底膜的組成，選擇不同交聯(lián)劑的用量來調(diào)節(jié)基底剛度以調(diào)控細(xì)胞的粘附和分化行為。