[發明專利]抑癌基因LKB1真核表達質粒的陽離子脂質體復合物及其制備方法和抗腫瘤作用

無效

• 申請號: 201310016953.2
• 申請日: 2013-01-17
• 公開（公告）號: CN103045634A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發明（設計）人: 朱文;魏于全;陳俐娟
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79;C12N15/54;C12N9/12;A61K48/00;A61K9/127;A61P35/00
• 代理公司: 成都虹橋專利事務所(普通合伙) 51124
• 代理人: 梁鑫

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體涉及抑癌基因LKB1真核表達質粒的陽離子脂質體復合物及其制備方法和抗腫瘤作用。

背景技術

肺癌是當今世界各國常見的惡性腫瘤，也是全世界發病率和死亡率增長最快,對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤。據WHO最新統計，每年全世界估計有超過200萬新肺癌患者，死亡約180萬人[1]。我國肺癌的發病率與死亡率呈快速上升的趨勢,肺癌已成為我國城市人口惡性腫瘤死亡原因的第一位。各國政府均投入了大量的人力和物力，以期在肺癌治療及研究領域有所突破。目前，肺癌的主要治療方式是外科手術治療、放療、化療等。但肺癌的治療效果不令人滿意，即使進行聯合化療，其有效率也只有30-40%，5年生存率只有4-15%。常規療法之下肺癌可憐的生存率要求有新的治療方法的出現。肺癌基因治療成為繼放療化療和手術治療之后極有發展前景的治療方法。近年來肺癌的基因治療取得了長足的進步，有的研究已進入臨床試驗階段[2,3]。

研究表明幾乎一半人類腫瘤都存在抑癌基因的失活,抑癌基因失活與腫瘤生長有著密切的關系。有研究報道多個抑癌基因的失活對腫瘤的發生和發展均具有協同促進作用[4,5]。因此,將正常的抑癌基因導入腫瘤細胞,去補償和代替突變或缺失的抑癌基因治療策略,將可能是腫瘤基因治療中一種重要的治療模式。

人的LKB1基因定位于19p13.3，整個基因跨度為23kb，其編碼一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，包括433個氨基酸，相對分子質量為50000。LKB1廣泛參與了許多細胞代謝進程如信號轉導、能量應激、細胞極性等[6,7]。近年來的研究表明LKB1的功能異常不僅是PJSPeutz-Jeghers綜合征的致病因素，同時LKB1還是一個新發現的重要的抑癌基因[8]。LKB1與肺癌、結腸癌、小腸癌、乳腺癌和卵巢癌等多種腫瘤的發生相關，在腫瘤的多種生化過程和信號傳導通路中發揮重要調節作用[9,10,11]。特別是最近的研究發現LKB1是肺腺癌中最常發生突變的五個基因之一，在17-54%的肺腺癌中存在LKB1失活突變[12],在肺腺癌以外的其他非小細胞肺癌中，也存在有LKB1的大量突變，LKB1作為一個新的抑癌基因在肺癌的發生、發展中起著非常重要的作用,參與調控了與腫瘤相關的細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡、侵襲遷移及血管生成等大量的生物學進程和信號傳導通路[13,14,15]。作為一個多功能激酶和腫瘤抑制因子，LKB1不但參與了肺癌的發生發展過程，也為肺癌的治療提供了極富前景的靶點。目前國內外還沒有利用LKB1用于肺癌基因治療及LKB1聯合其他基因用于肺癌聯合基因治療的實驗報道。有關LKB1抗腫瘤的分子機制也尚待深入研究。

此外，基因治療面臨的首要技術問題是基因的導入系統。目前基因治療中采用的靶基因導入系統主要為病毒載體和非病毒載體。在病毒載體中，腺病毒因具有肺的特異性、可感染分裂和非分裂細胞、在肺內轉化效率較高、不整合到染色體中等特點，成為肺癌基因治療最常用的一種載體。通過腺病毒介導基因的局部腫瘤治療雖然已經取得一些成績,但是由于腺病毒編碼蛋白可以激發機體的免疫反應,使病毒載體很快清除；同時,由于腺病毒載體全身用藥可能產生致命的過敏反應,只能用于腫瘤的局部注射治療,將這種載體用于肺癌、乳腺癌、結腸癌等全身性擴散的腫瘤疾病的治療顯然存在一定的局限。因此，對于肺癌等全身性擴散的腫瘤疾病的治療需要發展有效但不能激發機體免疫反應,且能夠全身給藥的安全的基因治療的靶基因載體。非病毒載體中最具典型的是陽離子脂質體(cationic?liposome)載體,它具有可自然降解、無免疫原性、適合大批量生產、對其所轉移的目的基因大小無限制、可重復轉染等優點，已經通過美國國立衛生研究院(NIH)和重組DNA咨詢委員會(RAC)的批準作為基因治療載體進入癌癥治療Ⅱ期臨床試驗，是近年發展起來的最有前途的基因治療載體[16]。有研究報道陽離子脂質體特別適宜肺腫瘤的基因轉移，當靜脈給予脂質體復合物時,肺部腫瘤組織是目的基因表達水平最高的器官，并且全身注射使用陽離子脂質體沒有發現明顯的器官相關毒性[17,18]。近年來陽離子脂質體在肺部腫瘤基因治療中已引起更多關注，探索高效低毒陽離子脂質體介導多基因共表達聯合治療肺癌可能是肺癌基因治療的一條新途徑。本領域目前在腫瘤治療方面尤其需要有新的選擇。

發明內容

本發明所要解決的第一個技術問題是提供一種能表達人LKB1蛋白的基因表達載體。該載體為重組質粒載體，裝載有編碼人LKB1蛋白的基因,能在真核細胞中表達人LKB1蛋白。