[發明專利]一種TAG代謝障礙型肥胖酵母模型的構建方法

有效

• 申請號: 201310016430.8
• 申請日: 2013-01-16
• 公開（公告）號: CN103103211A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 黃志偉;房志家;陳婷;張興群
• 申請（專利權）人: 東華大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/87;C12N1/19;C12R1/865
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所 31233
• 代理人: 黃志達

技術領域

本發明屬于酵母模型的構建領域，特別涉及一種TAG代謝障礙型肥胖酵母模型的構建方法。

背景技術

現有的降脂藥物篩選肥胖模型主要有（1）DIO(Diet-induced?Obese)模型，其特點是：通過給動物長期大量喂食高脂肪、高糖和高蛋白飼料，最終誘發肥胖及肥胖有關的代謝疾病，這一特點和部分人類肥胖的形成很相似。嚙齒動物在三高飼料飼喂下很容易肥胖，是最常用的DIO研究的動物模型。這一模型的優點是能夠很好的模擬人類肥胖，具有高度的相似性，能夠為藥物的動物試驗及臨床試驗提供依據，缺點是周期長，成本高，操作繁雜，且約一半的動物因存在食物抵抗并不能被誘導成肥胖模型，無滿足大規模高通量篩選的要求，因此不能作為降脂藥物篩選平臺。（2）下丘腦型肥胖模型，這類模型包括谷氨酸鈉和金硫葡萄糖誘發的肥胖動物模型，下丘腦控制的內分泌活動與肥胖的產生極其相關，通過注射谷氨酸鈉（MSG）能夠使下丘腦結節漏斗出多巴胺系統受損而致內分泌等功能低下，造成肥胖。而注射金硫葡萄糖（GTG）則直接損傷下丘腦弓狀核（ANH），促使動物多食，間而體重增加，血中TAG升高。這類模型克服了動物因食物抵抗而無法誘導成肥胖模型的問題，保證了模型建立的成功率，但依然沒有解決成本高，篩選規模小，周期長的缺點。（3）基因改造肥胖動物模型，這類模型主要是通過基因敲除脂類代謝相關基因造成營養代謝障礙來建立肥胖模型，如營養障礙性脂肪肝（fatty?liver?dystrophy）小鼠，這類模型的優點是，不用通過飼喂大量高脂高糖食物來誘導肥胖，能夠深入細致地明確一個或幾個基因的在肥胖形成中作用。不足之處為肥胖問題屬多基因多因素所致，而非少數基因的作用，并且模型建立技術復雜、成本高、周期長。另外，由于動物本身遺傳背景和修飾基因的不同，不一定會出現預期的表型。

酵母作為高等真核生物特別是人類基因研究的模式生物，1970年就曾報道酵母與人類著色性干皮病子核苷酸切除修復途徑上相似，而1990年發現人類著色性干皮病相關基因XPD與酵母RAD3有極高的同源性，Francoise等研究的人類170個基因中，其中42%與酵母基因有明顯的同源性。以酵母作為人類疾病模型有其獨到的優勢，2003年首個帕金森氏癥酵母模型誕生，而到2006年，Liebman通過阿茲海默癥酵母模型高通量篩選，識別出能夠抑制A-beta獨立聚集小分子，從而阻止了阿茲海默癥A-beta蛋白塊的形成，達到治療的目的。以酵母為模型的人類疾病研究具有同源性高，易于建立，成本低，運行周期短，操作簡便，可大規模篩選等優勢，具有上述幾種模型無可替代的作用。迄今未見有關肥胖相關酵母模型的建立，尚不存在用酵母肥胖模型篩選降脂藥物的案例。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種TAG代謝障礙型肥胖酵母模型的構建方法，該方法構建出的肥胖酵母模型主要有實驗周期短，建設成本低，運行耗費少，操作簡便等優勢；能夠為酵母和人類脂類代謝機制研究及降脂藥效評價提供平臺，是一個高效而可靠，簡便快捷的降脂藥物篩選模型。

本發明的一種TAG代謝障礙型肥胖酵母模型的構建方法，包括：

（1）以釀酒酵母BY4742α作為敲除對象，設計含有釀酒酵母基因組上TGL3和TGL4基因上下游同源序列的引物，利用PCR技術，以PRS400系列質粒為模板，擴增出含有篩選標記的DNA片段；通過釀酒酵母電轉化技術，將該DNA片段轉入釀酒酵母中，利用篩選型培養基篩選出成功敲除的酵母；

（2）利用Gap?repair技術獲取PAH1表達質粒YEplac195-PAH1：利用PCR技術擴增獲取PAH1上下游序列，并通過在擴增引物上分別設計上游的promoter區中的HindIII、NOTI和下游的terminator區中的BamHI、NOTI四個酶切序列及相應的保護堿基，以三片段一次性連接的方式將PAH1上下游序列插入到表達質粒YEplac195中；通過NOTI及terminate區上的PstI酶切位點對構建好的YEplac195-promoter-terminator進行雙酶切，創造出一個酵母難以通過自身連接修復的缺口Gap，通過釀酒酵母電轉化技術，將含有該Gap的質粒轉入酵母，使酵母以自身基因組作為修復Gap的模板，將PAH1基因復制到質粒中；通過篩選平板剔去沒有成功復制PAH1或修復YEplac195的酵母，針對篩選出來的酵母以酵母質粒提取技術進行質粒提取，并借助大腸桿菌DH5α進行富集，得到PAH1高表達質粒YEplac195-PAH1；