[發(fā)明專利]一種TAG代謝障礙型肥胖酵母模型的構建方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310016430.8
• 申請日: 2013-01-16
• 公開（公告）號: CN103103211A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發(fā)明（設計）人: 黃志偉;房志家;陳婷;張興群
• 申請（專利權）人: 東華大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/87;C12N1/19;C12R1/865
• 代理公司: 上海泰能知識產(chǎn)權代理事務所 31233
• 代理人: 黃志達

1.一種TAG代謝障礙型肥胖酵母模型的構建方法，包括：

（1）以釀酒酵母BY4742α作為敲除對象，設計含有釀酒酵母基因組上TGL3和TGL4基因上下游同源序列的引物，利用PCR技術，以PRS400系列質粒為模板，擴增出含有篩選標記的DNA片段；通過釀酒酵母電轉化技術，將該DNA片段轉入釀酒酵母中，利用篩選型培養(yǎng)基篩選TGL3TGL4雙缺陷型酵母；

（2）利用PCR技術擴增獲取PAH1上下游序列，并通過在擴增引物上分別設計上游的promoter區(qū)中的HindIII、NOTI和下游的terminator區(qū)中的BamHI、NOTI四個酶切序列及相應的保護堿基，以三片段一次性連接的方式將PAH1上下游序列插入到表達質粒YEplac195中；通過NOTI及terminate區(qū)上的PstI酶切位點對構建好的YEplac195-promoter-terminator進行雙酶切，創(chuàng)造出一個酵母難以通過自身連接修復的缺口Gap，通過釀酒酵母電轉化技術，將含有該Gap的質粒轉入酵母，使酵母以自身基因組作為修復Gap的模板，將PAH1基因復制到質粒中；通過篩選平板剔去沒有成功復制PAH1或修復YEplac195的酵母，針對篩選出來的酵母以酵母質粒提取技術進行質粒提取，并借助大腸桿菌DH5α進行富集，得到PAH1高表達質粒YEplac195-PAH1；

（3）利用釀酒酵母高效轉化方法將PAH1高表達質粒YEplac195-PAH1轉入TGL3和TGL4缺陷型酵母中，得到TAG代謝障礙型肥胖酵母模型。

2.根據(jù)權利要求1所述的一種TAG代謝障礙型肥胖酵母模型的構建方法，其特征在于：所述步驟（1）中的TGL3或TGL4基因上下游同源序列的引物序列具體為：

HO8-F:5'-GGAGTACAGGTATATGTAATAAAAGTCTGagattgtactgagagtgcac-3'；

HO9-R:5'-TAGAGGATATATAAGCAAGCCCGTGTTTTctgtgcggtatttcacaccg-3'；

HO79-F：5'-cgggatccGGCTCATTGCACGTTTGCAG-3'；

HO104-R:5'-ATGTAGTGGCGTCTTGGTTC-3'；

其中敲除TGL4基因所用引物為HO8-F和HO9-R，敲除TGL3基因所用引物為HO79-F和HO104-R；

步驟（2）中利用PCR技術擴增獲取PAH1上下游序列，其具體引物序列為

HO21-F:5'-cgggatcCGTTCGCAGTTCCTAACACTG-3'；

HO22-R:5'-ataagaatgcggccgCTATCTTCAGTAATTTCTTCC-3'；

HO23-F:5'-ataagaatgcggccgCGATCCATACTGCATATTAA-3'；

HO24-R:5'-acgccaagctTGGGCGTACAATAATTGCTT-3'；

其中PAH1上游DNA片段擴增所用引物為HO21-F和HO22-R，下游DNA片段擴增所用引物為HO23-F和HO24-R。

3.根據(jù)權利要求1所述的一種TAG代謝障礙型肥胖酵母模型的構建方法，其特征在于：所述步驟（1）中的PCR體系為ddH₂O14.2μL，10×PFU?PCR?Buffer2μL，HO8-F或HO79-F1μL，HO9-R或HO104-R1μL，10mM?dNTP0.3μL，5u/μL?PFU?DNA?Polymerase0.5μL，PRS405或PRS4001μL；PCR反應條件為變性溫度為95℃，退火溫度為55℃，72℃延伸時間為5分鐘，循環(huán)次數(shù)為35；

步驟（2）中的PCR反應體系為ddH₂O14.2μL，10×PFU?PCR?Buffer2μL，HO21或HO231μL，HO22或HO241μL，10mM?dNTP0.3μL，5u/μL?PFU?DNA?Polymerase0.5μL，Genetic?DNA1μL；PCR反應條件為變性溫度為95℃，退火溫度為55℃，72℃延伸時間為1分鐘，循環(huán)次數(shù)為33。