[發明專利]一種白樺葉片基因組DNA提取方法

無效

• 申請號: 201310016274.5
• 申請日: 2013-01-17
• 公開（公告）號: CN103013985A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 魏志剛;楊傳平;張力杰;曲贊霜;候聰
• 申請（專利權）人: 東北林業大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及的是一種高質量白樺葉片基因組DNA提取方法。

背景技術

高純度基因組DNA是基因組測序、基因克隆、分子雜交、基因文庫構建和分子標記等一系列分子生物學研究的前提。白樺葉片中酚類、多糖、萜類等次生物質含量較高，特別是生長在我國東北白樺，由于要適應東北地區較為嚴酷的地理及氣候環境，體內各種次生物質種類更多、含量更高，會對DNA的提取造成更為嚴重的影響。因此，如何去除這些雜質以獲得高質量的DNA是白樺葉片基因組DNA提取過程中面臨的主要問題，也是對白樺進行分子生物學研究的前提條件。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足提供一種高質量白樺葉片基因組DNA提取方法。

本發明的技術方案如下：

①葉片在加液氮的研缽中研磨至細末后，加入300μL改良STE溶液，300μL改良CTAB溶液（改良STE溶液和改良CTAB溶液等體積）和20μLβ—巰基乙醇，混合后震蕩3min；改良CTAB溶液配方：2.5﹪（W/V）CTAB，150mmol/LTris-Cl（pH8.0），20mmol/L?EDTA（pH8.0），1.4mmol/L?NaCl；改良SET溶液配方：150mmol/L?Tris-Cl（pH8.0），20mmol/L?EDTA（pH8.0），1.4mmol/LNaCl；

②常溫5000g離心5min,棄上清；向沉淀中加入加600μL改良CTAB溶液和20μLβ—巰基乙醇70℃水浴15min后16060g離心5min；

③取上清加入等體積氯仿充分混勻，16060g離心5min，重復此步驟1~2次；

④取上清加入等體積的無水乙醇:異丙醇混合液(體積比為2:1)，上下顛倒混合均勻后常溫下靜置3min，6080g離心3min；

⑤倒掉上清液，用70%預冷的乙醇洗滌2~3次，干燥后溶于50μL?TE或去離子水中；

⑥電泳檢測DNA的完整性，A260/280測定DNA濃度和純度。

本發明的提取方法方法能提取出高質量白樺葉片基因組DNA，其核心技術包括以下幾個內容：1、改良了CTAB與STE溶液；2、采用常溫下等體積的改良CTAB溶液和STE溶液洗滌經充分研磨的材料2次；3、水浴裂解溫度由65℃提高至70℃；4、在沉淀DNA時，采用無水乙醇:異丙醇(體積比為2:1)混合沉淀劑，低速離心，以降低雜質的沉淀。這種方法能分離出高質量的白樺葉片基因組DNA。

附圖說明

圖1為不同方法提取的白樺DNA電泳結果；1、2泳道：為CTAB法提取的DNA；3、4泳道：為SDS法提取的DNA；5、6泳道：方法Ⅲ提取的DNA電泳；7泳道：方法Ⅳ（STE洗滌1次）提取的DNA；8泳道：方法Ⅴ（CTAB洗滌1次）提取的DNA；

圖2為方法Ⅳ提取的白樺DNA電泳結果；1.和2泳道為STE和CTAB洗滌混合液洗滌1次后提取的白樺基因組DNA；3.和4泳道STE和CTAB洗滌混合液洗滌1次后提取的白樺基因組DNA；5.和6泳道為STE和CTAB洗滌混合液洗滌2次后提取的白樺基因組DNA；

圖3為方法Ⅳ提取的白樺DNA?EcoR?I與MseI酶切電泳結果；1.為白樺葉片基因組DNA；2.白樺葉片基因組DNA被EcoR?I酶切后電泳結果；3.白樺葉片基因組DNA被MseI酶電泳切結果；4.標準DNA分子量；5～7泳道為重復；

圖4為白樺不同個體葉片基因組DNA的RAPD擴增結果。

具體實施方式

以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。

材料：白樺葉片取自東北林業大學校園內已達開花結實的白樺，于8月未摘取的成熟葉片，葉片保存在-20℃冰箱。

試劑：

CTAB溶液：（2﹪（W/V）CTAB，100mmol/L?Tris-Cl（pH8.0），20mmol/LEDTA（pH8.0），1.4mmol/LNaCl）

STE溶液：（100mmol/L?Tris-Cl（pH8.0），20mmol/L?EDTA（pH8.0），

改良CTAB溶液：（2.5﹪（W/V）CTAB，150mmol/L?Tris-Cl（pH8.0），20mmol/L?EDTA（pH8.0），1.4mmol/LNaCl）；

改良SET溶液：（150mmol/L?Tris-Cl（pH8.0），20mmol/L?EDTA（pH8.0），1.4mmol/LNaCl）；