[發(fā)明專利]一種檢測甘蔗褐銹病菌的實時熒光定量PCR方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310015760.5
• 申請日: 2013-01-16
• 公開（公告）號: CN103060457A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發(fā)明（設計）人: 闕友雄;郭晉隆;許莉萍;張玉葉;羅俊;徐景升;黃寧;陳如凱
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/645
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發(fā)明涉及一種甘蔗病原菌的檢測方法，具體涉及一種檢測甘蔗褐銹病菌的實時熒光定量PCR方法，屬于生物技術領域。

背景技術

甘蔗褐銹病（Sugarcane?brown?rust?disease）是由屬于黑頂柄銹菌的甘蔗褐銹病菌（Puccinia?melanocephala）引起的一種真菌性病害。該病主要由夏孢子傳播，借風力附著在蔗葉表面，經氣孔侵入，從而危害甘蔗葉片，造成蔗莖產量損失和蔗糖分的降低。初次侵染源主要來自甘蔗本身或其他中間寄主。栽種抗褐銹病甘蔗品種，是控制甘蔗褐銹病的最為經濟有效的措施。

甘蔗褐銹病菌的檢測及其效率和準確性直接影響甘蔗抗褐銹病育種的進程和效果。迄今，已經有三種方法被證明可用于檢測待檢測甘蔗品種中是否含有褐銹病菌：第一種是分離培養(yǎng)技術，在建立純培養(yǎng)物的基礎上，根據培養(yǎng)物所產生孢子的形態(tài)特征進行鑒定；第二種是根據田間種植后病害表型癥狀鑒定；第三種是常規(guī)PCR檢測技術。以上三種方法中，分離培養(yǎng)技術耗時長，容易受雜菌污染，檢出效率不高；田間種植鑒定方法受甘蔗、病原菌和環(huán)境條件互作的影響，不僅耗時長，還存在鑒定結果不夠穩(wěn)定，波動較大的問題；常規(guī)PCR檢測技術靈敏度不夠高，且無法實時監(jiān)測PCR過程。實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過樣品到達域值水平所經歷的循環(huán)數（Ct值）對未知模板進行定量分析的方法。與常規(guī)PCR檢測技術相比，實時熒光定量PCR檢測技術，靈敏度高，特異性好，樣品消耗少，僅需1-10?ng的總RNA或基因組DNA，還能實時直觀地監(jiān)測P?CR擴增過程。綜上，目前已有的三種甘蔗褐銹病菌檢測技術，均有待進一步改進和完善，急需建立一種簡便、快速、準確和靈敏度高的檢測甘蔗褐銹病菌的實時熒光定量PCR方法。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供一種檢測甘蔗褐銹病菌的實時熒光定量PCR方法，可用于田間甘蔗褐銹病菌的早期診斷及檢測。

????本發(fā)明的一種檢測甘蔗褐銹病菌的實時熒光定量PCR方法，包括基因組DNA的提取、實時熒光定量PCR檢測體系建立、實驗有效性判定以及實時熒光定量PCR檢測，其特征在于：?

1、實時熒光定量PCR檢測體系的建立：實時熒光定量PCR擴增體系為總體積25?μl，內含12.5?μL?2×TaqMan?Universal?Master?Mix，10?μmol/L的檢測引物qPCR-F和qPCR-R各0.75?μL，0.4?μL?10?μmol/L探針，5-10?ng基因組DNA，ddH₂O補足到25?μl；?PCR擴增程序如下：50?℃?2?min，94?℃?10?min；90?℃?15?s，60?℃?1?min，40個循環(huán)，在60?℃進行單點熒光檢測；所述檢測引物和探針如下：??????

qPCR-F：5'-?TAACAATGGATCTCTAGGC?-3'，

qPCR-R：5'-?GCCACTTATACCTGATTAC?-3′,

探針：5'-?FAM-CCCCATTTTAAACA-TAMRA?-3′。

2、實驗有效性判定

同時具備a、b、c三個條件的實驗為有效實驗，否則為無效實驗；所述a、b、c三個條件如下：a、空白對照，無Ct值且無典型的擴增曲線；b、陰性對照，無Ct值且無典型的擴增曲線；c、陽性對照的Ct值≤30.0，并出現典型的擴增曲線；所述典型的擴增曲線如圖1所示，為S型動力學曲線；閾值線為以陰性對照樣品擴增曲線的最高點為基準，與橫坐標平行的一條直線；閾值線和典型的擴增曲線的交點所對應的定量PCR擴增循環(huán)數為Ct值；陽性對照為已知含甘蔗褐銹病菌的樣品；陰性對照為已知不含甘蔗褐銹病菌的樣品；空白對照指用等體積的無菌ddH₂O代替模板DNA；

3、實時熒光定量PCR檢測

實時熒光定量PCR檢測中，樣品檢測結果如下：

A、無Ct值且無典型的擴增曲線，表示樣品中不含甘蔗褐銹病菌；

B、Ct值≤35.0，且出現典型的擴增曲線，表示樣品中含甘蔗褐銹病菌；

C、當Ct值＞35.0，則該樣品做重復實驗；重復實驗結果無Ct值，則該樣品中不含甘蔗褐銹病菌；若重復實驗結果有Ct值且有典型的擴增曲線，則該樣品中含甘蔗褐銹病菌。

本發(fā)明的應用效果：