[發明專利]一種檢測甘蔗褐銹病菌的實時熒光定量PCR方法

無效

• 申請號: 201310015760.5
• 申請日: 2013-01-16
• 公開（公告）號: CN103060457A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 闕友雄;郭晉隆;許莉萍;張玉葉;羅俊;徐景升;黃寧;陳如凱
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/645
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

1.一種檢測甘蔗褐銹病菌的實時熒光定量PCR方法，包括基因組DNA提取、實時熒光定量PCR檢測體系建立、實驗有效性判定，以及實時熒光定量PCR檢測，其特征在于：?

（1）實時熒光定量PCR檢測體系的建立：實時熒光定量PCR擴增體系總體積為25?μl，內含12.5?μL?2×TaqMan?Universal?Master?Mix，10?μmol/L的檢測引物qPCR-F和qPCR-R各0.75?μL，0.4?μL?10?μmol/L探針，5-10?ng基因組DNA，ddH₂O補足到25?μl；?PCR擴增程序如下：50?℃?2?min，94?℃?10?min；90?℃?15?s，60?℃?1?min，40個循環，在60?℃進行單點熒光檢測；所述檢測引物和探針如下：??

qPCR-F：5'-?TAACAATGGATCTCTAGGC?-3'，

qPCR-R：5'-?GCCACTTATACCTGATTAC?-3′；

探針：5'-?FAM-CCCCATTTTAAACA-TAMRA?-3′；

（2）實驗有效性判定

同時具備a、b、c三個條件的實驗為有效實驗，否則為無效實驗；所述a、b、c三個條件如下：a、空白對照，無Ct值且無典型的擴增曲線；b、陰性對照，無Ct值且無典型的擴增曲線；c、陽性對照的Ct值≤30.0，并出現典型的擴增曲線；所述典型的擴增曲線為S型動力學曲線；閾值線為以陰性對照樣品擴增曲線的最高點為基準，與橫坐標平行的一條直線；閾值線和典型的擴增曲線的交點所對應的定量PCR擴增循環數為Ct值；陽性對照為已知含甘蔗褐銹病菌的樣品；陰性對照為已知不含甘蔗褐銹病菌的樣品；空白對照指用等體積的無菌ddH₂O代替模板DNA；

（3）實時熒光定量PCR檢測

實時熒光定量PCR檢測中，樣品檢測結果如下：

A、無Ct值且無典型的擴增曲線，表示樣品中不含甘蔗褐銹病菌；

B、Ct值≤35.0，且出現典型的擴增曲線，表示樣品中含甘蔗褐銹病菌；

C、當Ct值＞35.0，則該樣品做重復實驗；重復實驗結果無Ct值則該樣品中不含甘蔗褐銹病菌；若重復實驗結果有Ct值且有典型的擴增曲線，則該樣品中含甘蔗褐銹病菌。