[發(fā)明專(zhuān)利]一種檢測(cè)甘蔗黃銹病菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310015708.X
• 申請(qǐng)日: 2013-01-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103014172A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-04-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 闕友雄;許莉萍;張玉葉;郭晉隆;徐景升;羅俊;高世武;陳如凱
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 福建農(nóng)林大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;G01N21/64
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

1.一種檢測(cè)甘蔗黃銹病菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，包括基因組DNA提取、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系建立、實(shí)驗(yàn)有效性判定以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，其特征在于：?

（1）實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系的建立：實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系總體積為25?μl，內(nèi)含12.5?μL?2×TaqMan?Universal?Master?Mix，10?μmol/L的檢測(cè)引物qPCR-F和qPCR-R各0.75?μL，0.4?μL?10?μmol/L探針，5-10?ng基因組DNA，ddH₂O補(bǔ)足到25?μl；?PCR擴(kuò)增程序如下：50?℃?2?min，94?℃?10?min；90?℃?15?s，60?℃?1?min，40個(gè)循環(huán)，在60?℃進(jìn)行單點(diǎn)熒光檢測(cè)；所述檢測(cè)引物和探針如下：??

qPCR-F：5'-?TAACAATGGATCTCTAGGC?-3'；

qPCR-R：5'-?GTTAATAATGAGGTTTCCC?-3′；

探針：5'-?FAM-TATAACATTATCCCC-TAMRA-3′；

（2）實(shí)驗(yàn)有效性判定

同時(shí)具備a、b、c三個(gè)條件的實(shí)驗(yàn)為有效實(shí)驗(yàn)，否則為無(wú)效實(shí)驗(yàn)；所述a、b、c三個(gè)條件如下：a、空白對(duì)照，無(wú)Ct值且無(wú)典型的擴(kuò)增曲線；b、陰性對(duì)照，無(wú)Ct值且無(wú)典型的擴(kuò)增曲線；c、陽(yáng)性對(duì)照的Ct值≤30.0，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線；所述典型的擴(kuò)增曲線為S型動(dòng)力學(xué)曲線；閾值線為以陰性對(duì)照樣品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為基準(zhǔn)，與橫坐標(biāo)平行的一條直線；閾值線和典型的擴(kuò)增曲線的交點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的定量PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為Ct值；陽(yáng)性對(duì)照為已知含甘蔗黃銹病菌的樣品；陰性對(duì)照為已知不含甘蔗黃銹病菌的樣品；空白對(duì)照指用等體積的無(wú)菌ddH₂O代替模板DNA；

（3）實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)中，樣品檢測(cè)結(jié)果如下：

A、無(wú)Ct值且無(wú)典型的擴(kuò)增曲線，表示樣品中不含甘蔗黃銹病菌；

B、Ct值≤35.0，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，表示樣品中含甘蔗黃銹病菌；

C、當(dāng)Ct值＞35.0，則該樣品做重復(fù)實(shí)驗(yàn)；重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)Ct值則該樣品中不含甘蔗黃銹病菌；若重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有Ct值且有典型的擴(kuò)增曲線，則該樣品中含甘蔗黃銹病菌。