[發明專利]一種檢測甘蔗褐銹病菌或黃銹病菌的PCR方法

無效

• 申請號: 201310015703.7
• 申請日: 2013-01-16
• 公開（公告）號: CN103060456A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 闕友雄;郭晉隆;張玉葉;許莉萍;黃寧;羅俊;高世武;陳如凱
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/645
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明涉及一種甘蔗病原菌的檢測方法，具體涉及一種檢測甘蔗褐銹病菌或黃銹病菌的PCR方法，屬于生物技術領域。

背景技術

甘蔗銹病屬于真菌性病害，包括褐銹病和黃銹病，其中褐銹病由黑頂柄銹菌（Puccinia?melanocephala）引起，而黃銹病則由屈恩柄銹菌（Puccinia?kuehnii）引起。這兩種病菌都主要經由風力傳播，然后通過氣孔侵入，從而造成感病品種蔗莖產量和蔗糖分的嚴重損失。褐銹病主要在夏季流行，而黃銹病則在春季更流行。

甘蔗褐銹病和黃銹病都主要發生在葉片上，初次侵染源都來自甘蔗本身或其他中間寄主，但受侵染后癥狀表現不同：受褐銹病菌侵染后，初期甘蔗葉片上長出黃色小斑點，色澤呈褐色至橙褐色，周圍有黃色暈環，后期病斑因夏孢子堆呈膿皰狀，最后病斑變黑色，葉組織壞死，使甘蔗葉片失去光合能力，表現早衰；而受黃銹病菌侵染后，危害癥狀最初較輕，病斑不明顯，僅在葉片上產生淡黃色小斑點，隨病斑擴大，拉長的黃色病斑留下淺黃綠色暈圈，且顏色由桔色發展到橙棕色。但與一般的褐銹病不同，桔色銹斑從來不會發展為暗褐色。培育抗病品種，提高目標甘蔗品種的抗銹病性，并避免栽種感病品種，是控制甘蔗銹?。ê咒P病和黃銹?。┑淖顬榻洕行У拇胧Ｔ诟收峥逛P病育種過程中，如何檢測目標甘蔗品種中是否含有甘蔗褐銹病菌或黃銹病菌以及檢測的的效率和準確性直接影響甘蔗抗銹病育種的進程和效果。目前，一般采取兩種方法判斷種莖是否帶菌：一種是采用分離培養技術，在建立純培養物的基礎上，根據培養物所產生孢子的形態特征進行鑒定。甘蔗褐銹病的病原為黑頂柄銹菌，其夏孢子橙色或橙褐色，卵圓形至梨形，大小24.1～34.9×18.1～25.3?(μm)，具3～4個芽孔。夏孢子壁四周均勻加厚。冬孢子雙細胞，壁光滑，頂壁常加厚，棍棒狀，蒼白至磚色，大小28.9～45.8×14.5～21.7?(μm)，而甘蔗黃銹病的病原為屈恩柄銹菌，其夏孢堆葉背生，長0.5～1?mm，表皮破裂時散出肉桂色粉狀物。夏孢子卵圓形，表面具刺，淺黃色，大小25～42×17～25?(μm)，壁厚1.5～2.5?μm，赤道上有4個芽孔。冬孢子堆黑色，冬孢子長橢圓形，頂端圓或平，深褐色，大小30～56×15～22?(μm)，壁厚2～4.5?μm，具一隔膜，柄短，黃褐色；另一種是基于甘蔗褐銹病和黃銹病的表型癥狀不同，判斷是否發生銹病以及所發生的銹病為褐銹病或者黃銹病，因此，可以采用種莖種植后，觀察是否發生銹病以及所發生銹病的癥狀判斷待檢測甘蔗品種中是否含有褐銹病菌或黃銹病菌。但是，上述的第一種方法由于分離培養以及最終建立純培養物需要時間長，加上分離過程雜菌污染等，都會影響分離效果，檢出效率不高；第二種方法則受到甘蔗、環境條件和病原菌三個因素相互作用的影響，即便田間有病原、甘蔗基因型也是感病的，要發生病害，還需要合適的環境條件，這導致鑒定結果難以預料。同時，耗時長，工作量大，不同地點、不同年份間的鑒定結果亦存在較大差異。顯然，目前已有的技術方法，對于判斷種莖是否帶菌是不適用的，急需建立一種快速、準確，并能同時檢測區分甘蔗褐銹病菌和黃銹病菌的的PCR檢測方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種檢測甘蔗褐銹病菌（Puccinia?melanocephala）或黃銹病菌（Puccinia?kuehnii）的PCR方法，可用于田間甘蔗褐銹病菌和黃銹病菌的早期診斷及檢測。

????本發明的一種檢測甘蔗褐銹病菌或黃銹病菌的PCR方法，包括基因組DNA的提取、PCR檢測體系建立和PCR擴增產物的檢測，其特征在于：?

1、PCR檢測體系的建立：PCR擴增體系為總體積25?μl，內含2.5?μl?10×PCR緩沖液，2.5?μl?25?mmol/L?MgCl₂，0.5?μl?10?mmol/L?dNTP，10?μmol/L?的檢測引物PCR-F和PCR-R各1.0?μl，1.25?U?Taq?DNA?Polymerase，20-30?ng基因組DNA，ddH₂O補足到25?μl；PCR擴增程序如下：94?℃?4?min；94?℃?1?min，56?℃?45?s，72?℃?1?min，35個循環；72?℃8?min；所述10×PCR緩沖液組成成分為100?mmol/L?pH8.5?Tris-HCl，500?mmol/L?KCl和15?mmol/L?MgCl₂；所述檢測引物如下：??????

PCR-F：5'-?GAGCATCAAGGAAAGTAGCAA?-3′，