[發明專利]一種家蠶幼蟲體1-脫氧野尻霉素含量的測定方法

無效

• 申請號: 201310015381.6
• 申請日: 2013-01-16
• 公開（公告）號: CN103091421A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發明（設計）人: 時連根;張作法;劉淑梅;金衛明;費建明;李玉峰;趙麗華;施國方;黃秀娣
• 申請（專利權）人: 浙江大學;湖州市農業科學研究院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 林懷禹

技術領域

本發明涉及一種家蠶幼蟲體1-脫氧野尻霉素含量的測定方法。

背景技術

糖尿病是一種內分泌代謝紊亂的常見多發慢性病，臨床癥狀主表現為高血糖。隨著社會經濟條件的改善和飲食結構的改變，近年來糖尿病的患病率大幅度增長，已成為當今醫學上一個嚴重的公共衛生問題，給國民經濟發展造成了很大的影響。目前臨床上用于治療糖尿病的藥劑主要有胰島素類、磺酰脲類、雙胍類及α-糖苷酶抑制劑類這幾類，胰島素類、磺酰脲類、雙胍類藥物會引起肝損傷、血糖過低、水腫等，副作用較大，α-糖苷酶抑制劑為當前開發的重點領域。

1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）是一種α-糖苷酶抑制劑，可竟爭性地與α-糖苷酶結合，以阻害α-糖苷酶對二糖的水解，使二糖不能被水解成單糖進入血液內，而被直接送入大腸排泄，從而起到了有效降血糖的作用，是當前糖尿病治療藥物開發的一個嶄新領域。國外學者對DNJ進行了大量的研究，人工化學合成出了許多衍生物，其中N-羥乙基-1-DNJ被開發成了治療糖尿病的新藥---格列米醇（也叫格列本醇），于1998年用于臨床。但DNJ分子中具有多個（4個）手性中心，與其相關的立體異構體多達15種以上，人工化學合成的其衍生物在藥理藥效與毒副作用上與天然DNJ存在較大的差異，不能滿足當今社會的高水平需求。

家蠶是當今地球上室內飼養量最大的經濟資源昆蟲，不僅資源豐富，而且活性物質與營養成分充足，很適宜作為高效、安全生物反應器用于開發生產附價值高、發展前景廣闊的活性藥物。家蠶幼蟲體具有高效合成與富集DNJ的特性，不僅DNJ含量高，而且降血糖效果顯著，可用于糖尿病治療藥物和保健食品的開發。

發明內容

本發明的目的在于提供一種家蠶幼蟲體1-脫氧野尻霉素含量的測定方法，是用9-芴基氯甲酸甲酯（FMOC-Cl）標記DNJ，在配有熒光檢測器的反相高效液相色譜檢測，建立精確、穩定的家蠶幼蟲體DNJ含量檢測方法。

為了達到上述目的，本發明采用的技術方案如下：

1）家蠶幼蟲于-50℃下真空干燥36?h，于-15℃下超微粉碎10~15?min，過80~100目篩，得到家蠶幼蟲粉；

2）取家蠶幼蟲體粉，按重量體積比為1：700~800比例，加入0.05?mol/L?HCl，常溫下渦流15~20?s并超聲波處理20~30?min后，用21690?g離心20?min，收集上清液，沉淀物再按上述步驟提取一次，合并兩次上清液，定容得供試液；

3）取10?μL供試液，與10?μL?0.4?mol/L、pH8.5的硼酸鉀緩沖液混和，加入20?μL?5?mmol/L?FMOC-Cl液，混勻并在20℃水浴鍋中反應20~25?min，加10?μL?0.1mol/L甘氨酸液，中和剩余的FMOC-Cl來終止反應；

4）反應液用950?μL質量百分比為?0.1%醋酸液稀釋，生成的DNJ-FMOC，并用孔徑0.2?μm尼龍吸管式過濾器過濾，得測定液；

5）將10?μL測定液用進樣器注入色譜柱為DIAMONSIC?C₁₈柱的Waters?600高效液相色譜儀，以體積比為1：1的乙腈-0.1%醋酸為流動相，按1.0?mL/min流速在常溫下洗脫；

6）用激發光254?nm、發射光322?nm?的Waters?474熒光檢測器檢測洗脫曲線，根據DNJ-FMOC色譜峰面積按回歸方程Y=0.0002X+?2.9815計算出1-脫氧野尻霉素含量。

本發明具有的有益效果是：

本發明建立的家蠶幼蟲體1-脫氧野尻霉素含量測定方法，精密度、重現性與加樣回收率高，穩定地好，可用于大數量家蠶幼蟲制品中DNJ含量的檢測，這對于推進家蠶幼蟲體的藥用開發，具有積極的社會效益和經濟效益。

具體實施方式

實施例1：