[發(fā)明專(zhuān)利]鑒別馬立克氏病病毒血清1型疫苗毒的引物及試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310014600.9
• 申請(qǐng)日: 2013-01-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103131795A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 龍進(jìn)學(xué);張?zhí)?/a>;孫豐廷;鄭杰;張紅;楊國(guó)良;王亞麗;張凌云
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 北京華都詩(shī)華生物制品有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/70
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;張慶敏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物制品領(lǐng)域，特別是涉及用于鑒別馬立克氏病病毒血清1型疫苗毒的引物及試劑盒。

背景技術(shù)

馬立克氏病(Marek’s?disease，MD)又名神經(jīng)淋巴瘤病(neurolymphomatosis)，是由馬立克氏病病毒引起的一種具有高度傳染性、淋巴組織增生性腫瘤疾病，以對(duì)雞的外周神經(jīng)、性腺、虹膜、各種內(nèi)臟器官、肌肉和皮膚的單個(gè)或多個(gè)組織器官發(fā)生單核細(xì)胞浸潤(rùn)為特征，導(dǎo)致上述各器官和組織形成腫瘤。病雞常見(jiàn)消瘦、肢體麻痹，并常有急性死亡。在病原學(xué)上可以與雞的其他淋巴樣腫瘤病相區(qū)別。

目前在我國(guó)，馬立克氏病血清1型疫苗毒包括814株和CVI988株。814與CVI988在免疫效力上不分上下，但國(guó)內(nèi)在臨床上使用814和CVI988時(shí)，無(wú)法對(duì)免疫雞群進(jìn)行二者使用情況有效區(qū)分，從而容易產(chǎn)生混淆和糾紛。因此，建立一種能快速區(qū)別814與CVI988疫苗、甚至區(qū)分814與其他MDV血清1型野生強(qiáng)毒的簡(jiǎn)單快速方法，對(duì)我國(guó)自主研發(fā)的MDV病疫苗814的使用和推廣至關(guān)重要。同時(shí)，無(wú)論是814還是CVI988的使用，在臨床上，一直給MD的確切診斷帶來(lái)了很大的困難，因此，研究區(qū)分MDV疫苗毒和野毒的鑒別診斷一直受到極大的關(guān)注。例如有報(bào)道針對(duì)CVI988的基因組PP38的上游啟動(dòng)子序列有連續(xù)5個(gè)核苷酸缺失，而其他毒株包括814沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這樣的缺失，故針對(duì)此缺失，設(shè)計(jì)合成兩對(duì)引物，一對(duì)引物只能擴(kuò)增CVI988，另外一對(duì)引物能擴(kuò)增包括814在內(nèi)的其他MD血清一型病毒，在一次PCR后，可以把CVI988與其它病毒區(qū)分出來(lái)，但無(wú)法區(qū)分是疫苗毒814株還是野毒。因此，在生產(chǎn)及科研上，還不能把使用過(guò)814疫苗的雞群進(jìn)行MDV野毒感染的確定性診斷。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)雞外周血淋巴細(xì)胞馬立克病毒基因組DNA載量證實(shí)，強(qiáng)弱毒株的復(fù)制動(dòng)力學(xué)存在一定的差別，可作為MD早期診斷的標(biāo)準(zhǔn)，但是這種方法比較難運(yùn)用到實(shí)際生產(chǎn)中去。進(jìn)一步區(qū)分還需要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

2010年，韋平等開(kāi)發(fā)了“一種區(qū)分馬立克氏病病毒疫苗毒株與強(qiáng)毒株的鑒別方法”，該方法的工作原理：設(shè)計(jì)一對(duì)獨(dú)特的引物，能對(duì)所有MD血清1型病毒進(jìn)行有效擴(kuò)增，不同的病毒擴(kuò)增出不同大小的片斷：CVI988和814疫苗，擴(kuò)增出730左右的條帶，而其他野毒MDV擴(kuò)增出930以上的大條帶。因此，韋平的方法能把基因組很相近的疫苗毒和野強(qiáng)毒進(jìn)行一次PCR區(qū)分，解決了目前未能快速區(qū)分MDV疫苗毒和強(qiáng)毒的難題。但該方法仍然不能區(qū)分血清1型疫苗毒中的CVI988和814株。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供用于鑒別馬立克氏病病毒血清1型疫苗毒的引物。

本發(fā)明的另一目的在于提供用于鑒別馬立克氏病病毒血清1型疫苗毒的試劑盒。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，通過(guò)對(duì)目前已經(jīng)公開(kāi)的MDV全序列進(jìn)行詳細(xì)比較和分析（本發(fā)明的參考序列在NCBI中登陸號(hào)分別為：CVI988-DQ530348，GA-AF147806，LMS-JQ314003，MD5-AF243438，MD11-AY510475，RB-1B-EF523390，MD814-JF742597，JF742597）設(shè)計(jì)出能夠鑒別馬立克氏病病毒血清1型疫苗毒的引物。

本發(fā)明提供的用于鑒別馬立克氏病病毒血清1型疫苗毒的引物，包括SEQ?ID?NO.1~2所示的核苷酸序列。

本發(fā)明提供了SEQ?ID?NO.1~2所示的引物在鑒別馬立克氏病病毒血清1型疫苗毒中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種鑒別馬立克氏病血清1型疫苗毒株的診斷試劑，包括SEQ?ID?NO.1~2所示的引物。

本發(fā)明還提供了含有核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1~2所示的引物的試劑盒。

本發(fā)明的試劑盒，是采用核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1~2所示的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，有目的條帶擴(kuò)增的樣品為馬立克氏病病毒血清1型疫苗毒陽(yáng)性，否則為陰性。

進(jìn)一步地，采用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，只具有長(zhǎng)度為250bp的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶的樣品為馬立克氏病病毒血清1型疫苗毒CVI988株，具有長(zhǎng)度為250bp和750bp兩條特異產(chǎn)物條帶的樣品為馬立克氏病病毒血清1型疫苗毒814株。

進(jìn)一步地，上述PCR反應(yīng)條件為：95℃3min；94℃變性30sec，60℃退火30sec，72℃1min，循環(huán)40次；72℃10min。

更進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了含有核苷酸序列如SEQ?IDNO.1~2和SEQ?ID?NO.3~4所示的2對(duì)引物的試劑盒。

上述含有2對(duì)引物的試劑盒，其工作程序?yàn)椋?/p>