[發明專利]一種來源于圍產期胎盤血高殺傷K562細胞的CD3+CD56+細胞的制備方法

有效

• 申請號: 201310014428.7
• 申請日: 2013-01-15
• 公開（公告）號: CN103173409A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: 劉樂鋒;王溢文;魏昌盛;林強;劉洋
• 申請（專利權）人: 江蘇和澤生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 北京聯瑞聯豐知識產權代理事務所(普通合伙) 11411
• 代理人: 曾少麗

技術領域

本發明涉及一種細胞培養和免疫療法，尤其涉及一種高殺傷K562細胞的CD3⁺CD56⁺細胞的制備方法。?

背景技術

CD3⁺CD56⁺細胞是一種在體外利用多種細胞因子誘導的免疫細胞。由人血液中的單個核細胞在體外用多種細胞因子共同培養一段時間后獲得。由于該種細胞同時表達CD3⁺（CD3⁺為T細胞表面特異性蛋白，僅存在于T細胞表面）和CD56⁺（CD56⁺為NK細胞表面特異性蛋白）兩種膜蛋白分子,故又被稱為NK細胞（natural?killer?cell，自然殺傷細胞）樣T淋巴細胞（NKT細胞）,兼具T淋巴細胞強大的抗瘤活性和NK細胞的非MHC（major?histocompatibility?complex主要組織相容性復合體）限制性殺瘤優點。相對于LAK細胞（lymphokine?activated?killer?cells，淋巴因子激活的殺傷細胞）以及CTL細胞（cytotoxic?T-lymphocyte?cells，細胞毒性T淋巴細胞），其表現出更強的殺傷能力與更廣的殺瘤譜。?

CD3⁺CD56⁺細胞在正常人外周血中含量極低，僅1%—5%。因此，在體外培養中，提高其絕對數量對提高臨床治療效果至關重要。目前的經典制備方法為：采集人體外周血，分離得到單個核細胞，將單個核細胞置于培養液中，加入多種細胞因子誘導其分化（如抗CD3單克隆抗體、IL-2和IFN-γ等）培養至第21天，收獲得到CD3⁺CD56⁺細胞。但這種方法獲得的CD3⁺CD56⁺細胞的培養周期過長且細胞毒活性不夠理想。?

以下是現有技術的一種方案：?

1、采集自體外周血，存放于密閉容器中，以枸櫞酸鈉抗凝。?

2、將采集的血液經離心分離，得到外周血單個核細胞。?

3、調節細胞濃度1×10⁶/mL，并加入細胞因子IFN-γ至其終濃度為1000U/mL，于37℃,5%CO₂培養箱中孵育24h。?

4、24h后加入IL-2、抗CD3單克隆抗體及IL-1，至IL-2終濃度為300～500U/mL，抗CD3單克隆抗體終濃度為50ng/mL及IL-1終濃度為100U/mL。之后每隔3天半量換液，全量補充IL-2。?

5、第21天收獲細胞。?

此方案的缺點是：?

1、現有技術采用病人自體外周血，受病人個體差異的影響較大，不利于產業化制備，給臨床推廣帶來了難度。?

2、外周血屬于發育成熟的機體組織，細胞增殖潛力較小，受病毒感染的風險高，且年齡越大細胞活性越低。?

3、枸櫞酸鈉抗凝劑本身對細胞有一定的毒性，并且其用量較大，堿性強，對血液成分的影響較大。?

4、現有技術所制備的免疫細胞，其對腫瘤細胞的殺傷性還有待提高。?

有鑒于此，如何設計一種CD3⁺CD56⁺細胞的制備方法，以解決現有技術制備周期較長及細胞的增值潛力較小的現象，是業內人士亟需解決的問題。?

發明內容

針對現有技術中，血液成分的穩定性不佳、采集過程缺乏安全性，并且細胞的制備周期較長，增殖潛力較小等缺陷，本發明提供了一種來源于圍產期胎盤血高殺傷K562細胞的CD3⁺CD56⁺細胞的制備方法。?

根據本發明，提供了一種來源于圍產期胎盤血高殺傷K562細胞的CD3⁺CD56⁺細胞的制備方法，其中，從圍產期胎盤血中分離單個核細胞以誘導分化形成CD3⁺CD56⁺細胞。?

優選地，包括以下步驟：?

a.采集所述圍產期胎盤血于密閉容器內；?

b.從所述圍產期胎盤血中分離單個核細胞；以及?

c.誘導分化所述單個核細胞。?

優選地，所述步驟a中，所述圍產期胎盤血以含肝素鈉抗凝劑抗凝。?