[發明專利]一種來源于圍產期胎盤血高殺傷K562細胞的CD3+CD56+細胞的制備方法

有效

• 申請號: 201310014428.7
• 申請日: 2013-01-15
• 公開（公告）號: CN103173409A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: 劉樂鋒;王溢文;魏昌盛;林強;劉洋
• 申請（專利權）人: 江蘇和澤生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 北京聯瑞聯豐知識產權代理事務所(普通合伙) 11411
• 代理人: 曾少麗

1.一種來源于圍產期胎盤血高殺傷K562細胞的CD3⁺CD56⁺細胞的制備方法，其特征在于，從圍產期胎盤血中分離單個核細胞以誘導分化形成CD3⁺CD56⁺細胞。?

2.如權利要求1所述的來源于圍產期胎盤血高殺傷K562細胞的CD3⁺CD56⁺細胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：?

a.采集所述圍產期胎盤血于密閉容器內；?

b.從所述圍產期胎盤血中分離單個核細胞；以及?

c.誘導分化所述單個核細胞。?

3.如權利要求1所述的來源于圍產期胎盤血高殺傷K562細胞的CD3⁺CD56⁺細胞的制備方法，其特征在于，所述步驟a中，所述圍產期胎盤血以含肝素鈉抗凝劑抗凝。?

4.如權利要求3所述的來源于圍產期胎盤血高殺傷K562細胞的CD3⁺CD56⁺細胞的制備方法，其特征在于，用含肝素鈉抗凝劑的采血袋進行采血，搖勻后，將所述采血袋和生物冰袋一起放入保溫箱，保持溫度為4～25℃，溫差不超過±5℃，在6小時內運送所述采血袋至實驗室，且運輸途中避免血液經X線照射并遠離輻射源。?

5.如權利要求1所述的來源于圍產期胎盤血高殺傷K562細胞的CD3⁺CD56⁺細胞的制備方法，其特征在于，所述步驟b包括：?

b1.向第一離心管中加入淋巴細胞分離液，將所述圍產期胎盤血以等體積D-Hank's液稀釋混勻，并將稀釋后的所述圍產期胎盤血緩慢疊加于所述淋巴細胞分離液之上，保持液層分界清晰；稀釋后的所述圍產期胎盤血體積與所述淋巴細胞分離液體積比為2:1；?

b2.將所述第一離心管進行離心，其中，以800～1200g的離心力在10～25℃下離心25～30min；?

b3.吸取所述第一離心管內的上層血漿，密封并冷藏，冷藏溫度為-20℃，吸取所述第一離心管內的單個核細胞層液體，移入第二離心管內；?

b4.向所述第二離心管內加入D-Hank's液以稀釋所述單個核細胞層液體，所述D-Hank's液與所述單個核細胞層液體的體積比為5：1，離心洗滌所述第二離心管，去除上清；以及?

b5.用含體積濃度為10%胎牛血清的RPMI-1640培養液重懸所述單個核細胞，調節所述單個核細胞密度為1～3×10⁶/mL。?

6.如權利要求5所述的來源于圍產期胎盤血高殺傷K562細胞的CD3⁺CD56⁺細胞的制備方法，其特征在于，所述步驟b4中，以300～500g的離心力在4℃下離心5～10min。?

7.如權利要求1至6任一項所述的來源于圍產期胎盤血高殺傷K562細胞的CD3⁺CD56⁺細胞的制備方法，其特征在于，所述步驟c包括：?

c1.將所述步驟b5中的所述含單個核細胞的培養液移入培養瓶，加入IFN-γ至所述IFN-γ終濃度為500～1600U/mL，將所述培養瓶置于37℃,CO₂的體積濃度為5%的培養箱中孵育24h；?

c2.繼續向所述培養瓶內加入IL-2、抗CD3單克隆抗體、SCF及IL-1至所述IL-2終濃度為500～1000U/mL，所述抗CD3單克隆抗體終濃度為50～100ng/mL，所述SCF終濃度為40～80ng/mL及所述IL-1終濃度為100～300U/mL，然后每隔1～3天半量換液，全量補充IL-2、抗CD3單克隆抗體、IL-1、SCF，保證細胞密度處于1～3×10⁶/mL；以及?

c3.至第14～17天收獲經分化的所述單個核細胞，離心并用所述培養液重懸，檢測所述單個核細胞中CD3⁺CD56⁺細胞含量。?

8.如權利要求7所述的來源于圍產期胎盤血高殺傷K562細胞的CD3⁺CD56⁺細胞的制備方法，其特征在于，所述步驟c1中，所述IFN-γ的終濃度為1000U/mL。?