[發明專利]細粒棘球蚴重組BCG疫苗及制備方法

無效

• 申請號: 201310013855.3
• 申請日: 2013-01-14
• 公開（公告）號: CN103041382A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發明（設計）人: 丁劍冰;馬海梅;祖力皮也·吐爾遜;馬秀敏;曹春寶;德里夏提·依米提;朱明;溫浩
• 申請（專利權）人: 新疆醫科大學
• 主分類號: A61K39/00
• 分類號: A61K39/00;A61P33/10;C12N15/12;C12N15/74;C12N1/21
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域

本發明提供了一種細粒棘球絳蟲重組BCG疫苗，用于預防控制動物細粒棘球蚴病，同時還提供了該疫苗的制備方法，屬于疫苗制備技術領域。?

背景技術

棘球蚴病（cystic?echinococcosis,CE）是一種嚴重危害人們身體健康的人畜共患寄生蟲病，已成為農牧民因病致貧，因病返貧的主要因素之一。目前對包蟲病患者進行包蟲囊摘除術是首選的治療方法。但手術對人體帶來的損傷比較大且有可能復發,?化療藥物可產生一些嚴重的不良反應。因此，需要研究更有效的解決方法,而疫苗預防是防治其流行的有效措施。?

預防細粒棘球蚴病的疫苗經歷了多肽疫苗，亞單位疫苗，DNA疫苗等多種探索，隨著生物技術的發展，重組活疫苗的制備得到了一種新的方法。基因重組卡介苗(rBCG)是借助基因工程技術，將外源基因導入BCG?中構建而成的多價疫苗（rBCG），可誘導長期的體液免疫和細胞免疫，近幾年的研究結果已顯示出rBCG具有非常好的應用前景，有望發展成為預防疾病的一種實際可用的新型疫苗。?

本發明小組曹春寶等從細粒棘球蚴中克隆了egG1Y162抗原基因。結果顯示，egG1Y162基因不論是在基因序列上，還是在氨基酸序列及蛋白結構上均與國外研究者已研發出的用于終末宿主保護的?候選疫苗emY162有高度的相似性，很可能也是終末宿主的保護性抗原。?

雖然使用BCG構建多價疫苗在本領域已經熟知，但影響疫苗效率的因素有很多，如何研發出預防棘球蚴病的高效疫苗仍然是亟待解決的技術問題。?

發明內容

本發明提供了一種細粒棘球絳蟲重組BCG疫苗，為穿梭表達載體細粒棘球絳蟲重組BCG疫苗，具有熱穩定性好，便于運輸和保存，免疫力持久，免疫次數少，免疫程序簡化，增強了針對細粒棘球蚴病的免疫效果。生產成本少，便于生產等特點。?

本發明還公開了細粒棘球絳蟲重組BCG疫苗的制備方法，以利于工業化生產。?

本發明重組細粒棘球絳蟲BCG疫苗的解決方案如下：首先獲得細粒棘球絳蟲保護性抗原基因，進行TA克隆，將測序正確的目的片段酶切回收，再與經同樣酶切的大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達載體PMV361相連，構建重組表達載體，將重組表達載體電轉化入BCG，經抗性篩選和PCR擴增篩選得到陽性抗細粒棘球絳蟲重組BCG克隆。?

本發明所提供的重組細粒棘球絳蟲BCG疫苗的制備方法，其包括如下步驟：?

（1）合成上游和下游引物：?

上游引物：5′-CCGAATTCATGGTACTTCGATTCTGT-3′；?

下游引物：5′-CCAAGCTTAGTAAGTAATAGGAGCCCA-3′；?

（2）目的基因egG1Y162的PCR擴增：?

以細粒棘球蚴cDNA為模板，采用上述的上下游引物，進行PCR擴增，擴增體系為：滅菌水16μl，質粒2μl，EcoRI?0.5μl，HindⅢ?0.5μl，mix?20μl，共40μl擴增體系；Touchdown?PCR反應條件：95℃?4?min；95℃?30s，65℃?30s?降1℃，72℃?2min?共11個循環；95℃?30s，50℃?30s，75℃?2min?共25個循環；最后72℃?延伸，7min，末次4℃，將PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到大小為360bp的目的條帶；?

（3）目的片段egG1Y162與載體PMV361的連接：?

egG1Y162擴增產物經DNA純化試劑盒純化回收后先與PMD19-T載體連接，利用α互補原則篩選陽性克隆并進行PCR擴增鑒定、酶切鑒定和測序鑒定，將經上述鑒定正確的陽性克隆擴增后提取egG1Y162-PMD19質粒，將該質粒經EcoRI、HindⅢ?限制性內切酶酶切，凝膠回收目的片段后與同樣用EcoRI和HindⅢ進行雙酶切的pMV361質粒膠回收產物，按3∶1的摩爾比(目的片段∶載體)在T4DNA連接酶的催化下進行連接，連接體系為：buffer緩沖液1?μl，目的片段7?μl，PMV361載體1?μl?，T4?DNA連接酶1?μl，共10μl的連接體系，16℃，連接過夜。轉化入E.coli?DH5α感受態細胞后，利用PMV361質粒所攜帶的卡那霉素抗性篩選egG1Y162-PMV361重組子，對陽性克隆進行PCR擴增鑒定和EcoRI和HindⅢ雙酶切鑒?定，將鑒定正確的重組質粒命名為egG1Y162-PMV361；?