[發明專利]細粒棘球蚴重組BCG疫苗及制備方法

無效

• 申請號: 201310013855.3
• 申請日: 2013-01-14
• 公開（公告）號: CN103041382A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發明（設計）人: 丁劍冰;馬海梅;祖力皮也·吐爾遜;馬秀敏;曹春寶;德里夏提·依米提;朱明;溫浩
• 申請（專利權）人: 新疆醫科大學
• 主分類號: A61K39/00
• 分類號: A61K39/00;A61P33/10;C12N15/12;C12N15/74;C12N1/21
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.重組細粒棘球絳蟲BCG疫苗的制備方法，其包括如下步驟：

（1）合成上游和下游引物：

上游引物：5′-CCGAATTCATGGTACTTCGATTCTGT-3′；

下游引物：5′-CCAAGCTTAGTAAGTAATAGGAGCCCA-3′；

（2）目的基因egG1Y162的PCR擴增：

以細粒棘球蚴cDNA為模板，采用上述的上下游引物，進行PCR擴增，擴增體系為：滅菌水16μl，質粒2μl，EcoRI?0.5μl，HindⅢ?0.5μl，mix?20μl，共40μl擴增體系；Touchdown?PCR反應條件：95℃?4?min；95℃?30s，65℃?30s?降1℃，72℃?2min?共11個循環；95℃?30s，50℃?30s，75℃?2min?共25個循環；最后72℃?延伸，7min，末次4℃，將PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到大小為360bp的目的條帶；

（3）目的片段egG1Y162與載體PMV361的連接：

egG1Y162擴增產物經DNA純化試劑盒純化回收后先與PMD19-T載體連接，利用α互補原則篩選陽性克隆并進行PCR擴增鑒定、酶切鑒定和測序鑒定，將經上述鑒定正確的陽性克隆擴增后提取egG1Y162-PMD19質粒，將該質粒經EcoRI、HindⅢ?限制性內切酶酶切，凝膠回收目的片段后與同樣用EcoRI和HindⅢ進行雙酶切的pMV361質粒膠回收產物，按3∶1的摩爾比(目的片段∶載體)在T4DNA連接酶的催化下進行連接，連接體系為：buffer緩沖液1?μl，目的片段7?μl，PMV361載體1?μl?，T4?DNA連接酶1?μl，共10μl的連接體系，16℃，連接過夜。轉化入E.coli?DH5α感受態細胞后，利用PMV361質粒所攜帶的卡那霉素抗性篩選egG1Y162-PMV361重組子，對陽性克隆進行PCR擴增鑒定和EcoRI和HindⅢ雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質粒命名為egG1Y162-PMV361；

（4）重組egG1Y162-PMV361載體的電轉化

將-80℃保存的BCG菌株復蘇后接種于含10%?OADC的7H9液體培養基，?180r／min?，37℃?，震蕩培養至對數生長期，即培養液變混濁,?沙樣生長后用于感受態細胞的制備。取在7H9液體培養基上生長良好的BCG培養物，?37℃繼續震蕩培養10天，4℃，5000?r/min離心10min?收集菌體，以滅菌10%甘油洗滌4次，最后一次用適量的10%甘油重懸菌體，即得到BCG感受態細胞。分別將egG1Y162-PMV361質粒及空質粒pMV361經電穿孔法分別轉化入BCG感受態細胞中，具體電轉化條件為：電容25Uf，電阻1000Ω，場強18×105V/?m?，轉化時間為5?ms，轉化次數為3；放電結束后將100μL菌液立即轉移入1?mL?7H9液體培養液中，37℃震蕩培養過夜（>24h）。取培養過夜的轉化后菌液800r/min室溫離心10min，取沉淀100μL均勻涂布于含OADC和30μg/ml卡那霉素的7H10固體培養基表面，?37℃培養3-4周，培養基表面見轉化后菌落生長。從7H10固體培養基平板表面挑取BCG重組子，接種于罕OADC的7H9液體培養基中，?37℃?，培養至對數生長期，取菌液進行PCR擴增鑒定證實為陽性克隆后，分別命名為egG1Y162-PMV361-rBCG及PMV361-?rBCG；

（5）重組egG1Y162-PMV361-rBCG的誘導表達

將經PCR擴增鑒定證實含有egG1Y162-PMV361質粒的rBCG陽性克隆接種在含30μg/ml?卡那霉素的7H9液體培養基中，37℃，180r/min振搖培養至對數生長期(需3w左右)，進行45℃熱誘導45min，離心收集菌體；加入1ml預冷的磷酸鹽緩沖液重懸菌泥后超聲粉碎，再加入等體積2×SDS-PAGE上樣緩沖液，100℃煮沸5min，冰浴5min，4℃，12000rpm離心5min；取10μl上清進行SDS-PAGE分析，最終獲得的egG1Y162-PMV361-rBCG表達的融合抗原，其分子量約為71KD。