[發明專利]煙草及煙草制品中黃曲霉毒素的酶聯免疫測定方法

有效

• 申請號: 201310013311.7
• 申請日: 2013-01-15
• 公開（公告）號: CN103063831A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 陳歡;劉彤;侯宏衛;韓書磊;龐永強;姜興益;李中皓;張洪非;李雪;劉楠;胡清源
• 申請（專利權）人: 國家煙草質量監督檢驗中心
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司 41110
• 代理人: 姜振東

技術領域：

本發明涉及煙草及煙草制品中黃曲霉毒素（AFT）的測定技術，具體說是涉及一種煙草及煙草制品中黃曲霉毒素的酶聯免疫測定方法。

背景技術：

煙草是世界許多地區的主要經濟作物。但是，在煙葉初加工、貯運、煙廠生產和煙制品銷售等環節中，一旦溫度、濕度和水分等環境條件適宜,極易滋生各種微生物而使煙葉發霉變質，致使煙葉及其制品產量降低，品質下降，造成重大的經濟損失。在煙草行業中，控制煙葉的霉變，不僅僅為了降低因煙葉霉變造成的經濟損失，更是出于保障卷煙產品安全性的目的。

已報道的能使煙葉、煙絲和卷煙霉變的霉菌多達130屬231種。常見霉菌的優勢菌主要有曲霉、青霉和毛霉等。這些霉菌除了影響煙葉品質外，還包括黃曲霉、赭曲霉、煙曲霉、構巢曲霉、桔青霉等產毒霉菌，產毒霉菌會通過自身代謝產生對人體有顯著毒性霉菌毒素，如黃曲霉毒素、赭曲霉毒素等。其中，黃曲霉毒素是目前發現最強的化學致癌物質，其毒性是氰化鉀的10倍，是砒霜的68倍。目前，食品及飼料中真菌毒素的檢測已引起了國際上許多國家的高度重視。我國針對食品及飼料中的真菌毒素制定了嚴格的檢測標準和限量要求，是重要的安全性評價指標。卷煙作為一種供消費者吸食的特殊商品，其衛生指標和安全性一直受到消費者和煙草行業的高度關注。目前，還沒有相關文獻和專利報道我國煙草及煙草制品中真菌毒素的測定方法。

目前針對食品中黃曲霉毒素的檢測方法主要為兩種，一種是液相色譜與熒光檢測器或質譜檢測器聯用技術，另一種是酶聯免疫測定方法（ELISA）。后者利用免疫、酶及生化技術聯用實現黃曲霉毒素含量的測定。該方法具有特異性好，檢測結果穩定準確，實驗操作簡便，檢測通量高、可實現現場分析等優勢。

發明內容：

本發明的目的正是基于上述現有技術狀況而提供一種適用于煙草及煙草制品中黃曲霉毒素測定的酶聯免疫測定方法，本發明通過優化煙草及煙草制品中黃曲霉毒素的提取方法，使用表面修飾抗體，內部包埋辣根過氧化物酶（HRP酶）的脂質體作為信號放大技術，提高酶聯免疫檢測方法的靈敏度。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：

一種煙草及煙草制品中黃曲霉毒素的酶聯免疫測定方法，包括以下工藝步驟：

（1）樣品前處理：煙葉樣品或煙絲在40?℃下烘干，在粉碎機上粉碎，過40目篩；

（2）樣品中黃曲霉毒素的提取：稱取5?g經前處理的煙末樣品和0.5?g氯化鈉置于100?mL具塞錐形燒瓶中，加入20?mL的80%的甲醇水溶液，蓋好蓋子置于振蕩器上高速振蕩5分鐘，靜置3分鐘使樣品沉淀，用玻璃纖維濾紙過濾10?mL萃取液，收集濾液到干凈容器中，取5?mL萃取液，加入20?mL水稀釋，混勻后待測；

（3）標準工作液的配制：用16%的甲醇水溶液配制不同濃度的黃曲霉毒素標準工作溶液，濃度分別為1?ng/mL,2?ng/mL,7.5?ng/mL，25?ng/mL,100?ng/mL。

（4）酶聯免疫法測定：在96孔板表面固定黃曲霉毒素-牛血清白蛋白（AFT-BSA）偶聯物，加入標準工作溶液或檢測樣品，隨后立即加入表面抗體修飾、辣根酶包埋的脂質體溶液，反應20分鐘后清除微孔板內溶液并洗滌，加入含有1%十二烷基磺酸鈉（SDS）的四甲基聯苯胺（TMB）底物，避光反應20分鐘，加入終止液，在450nm處檢測紫外吸收。

本發明中，在酶標板中進行偶聯抗原的包被，通過對包被抗原濃度進行優化，偶聯物濃度達到25μg/mL時為最佳，向96孔微孔板中加入由包被液稀釋的25μg/mL的偶聯抗原（AFT-BSA），每孔100μL，4℃過夜。

酶聯免疫法測定的具體步驟如下：

(1)抗原包被：酶標板中加入由包被液稀釋的25μg/mL的黃曲霉毒素-牛血清白蛋白（AFT-BSA）偶聯抗原，每孔100μL，4℃過夜；

(2)洗板：用PBS緩沖液洗板3次，每次5min；

(3)封閉：每孔加入100μL封閉液，37℃封閉1h，重復洗板過程；

(4)加AFT標準品和抗體標記的脂質體：加入50μL不同濃度的AFT標準品或待測樣品；隨后加入50μL表面標記抗體內部包埋HRP酶的脂質體溶液，室溫下孵育30min，進行間接競爭ELISA反應，重復洗板過程，最后一次清洗完成后，倒掉孔中溶液，然后翻轉微孔板在吸水紙上拍干；

(5)加入底物：每孔加入100μL含有1%十二烷基磺酸鈉（SDS）的四甲基聯苯胺（TMB）底物，室溫下避光反應30min；