[發明專利]煙草及煙草制品中黃曲霉毒素的酶聯免疫測定方法

有效

• 申請號: 201310013311.7
• 申請日: 2013-01-15
• 公開（公告）號: CN103063831A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 陳歡;劉彤;侯宏衛;韓書磊;龐永強;姜興益;李中皓;張洪非;李雪;劉楠;胡清源
• 申請（專利權）人: 國家煙草質量監督檢驗中心
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司 41110
• 代理人: 姜振東

1.一種煙草及煙草制品中黃曲霉毒素的酶聯免疫測定方法，其特征在于：包括以下工藝步驟：

（1）樣品前處理：煙葉樣品或煙絲在40?℃下烘干，在粉碎機上粉碎，過40目篩；

（2）樣品中黃曲霉毒素的提取：稱取5?g經前處理的煙末樣品和0.5?g氯化鈉置于100?mL具塞錐形燒瓶中，加入20?mL的80%的甲醇水溶液，蓋好蓋子置于振蕩器上高速振蕩5分鐘，靜置3分鐘使樣品沉淀，用玻璃纖維濾紙過濾10?mL萃取液，收集濾液到干凈容器中，取5?mL萃取液，加入20?mL水稀釋，混勻后待測；

（3）標準工作液的配制：用16%的甲醇水溶液配制不同濃度的黃曲霉毒素標準工作溶液；

（4）酶聯免疫法測定：在96孔板表面固定黃曲霉毒素-牛血清白蛋白（AFT-BSA）偶聯物，加入標準工作溶液或檢測樣品，隨后立即加入表面抗體修飾、辣根酶包埋的脂質體溶液，反應20分鐘后清除微孔板內溶液并洗滌，加入含有1%十二烷基磺酸鈉（SDS）的四甲基聯苯胺（TMB）底物，避光反應20分鐘，加入終止液，在450nm處檢測紫外吸收。

2.根據權利要求1所述的煙草及煙草制品中黃曲霉毒素的酶聯免疫測定方法，其特征在于：黃曲霉毒素的濃度分別為1?ng/mL,2?ng/mL,7.5?ng/mL，25?ng/mL,100?ng/mL。

3.根據權利要求1所述的煙草及煙草制品中黃曲霉毒素的酶聯免疫測定方法，其特征在于：偶聯物濃度為25μg/mL。

4.根據權利要求1所述的煙草及煙草制品中黃曲霉毒素的酶聯免疫測定方法，其特征在于：酶聯免疫法測定的具體步驟如下：

(1)抗原包被：酶標板中加入由包被液稀釋的25μg/mL的黃曲霉毒素-牛血清白蛋白（AFT-BSA）偶聯抗原，每孔100μL，4℃過夜；

(2)洗板：用PBS緩沖液洗板3次，每次5min；

(3)封閉：每孔加入100μL封閉液，37℃封閉1h，重復洗板過程；

(4)加AFT標準品和抗體標記的脂質體：加入50μL不同濃度的AFT標準品或待測樣品；隨后加入50μL表面標記抗體內部包埋HRP酶的脂質體溶液，室溫下孵育30min，進行間接競爭ELISA反應，重復洗板過程，最后一次清洗完成后，倒掉孔中溶液，然后翻轉微孔板在吸水紙上拍干；

(5)加入底物：每孔加入100μL含有1%十二烷基磺酸鈉（SDS）的四甲基聯苯胺（TMB）底物，室溫下避光反應30min；

(6)終止反應：每孔加入100μL終止液，終止反應；

(7)檢測：用紫外可見分光光度計測定450nm處的吸光度。

5.根據權利要求4所述的煙草及煙草制品中黃曲霉毒素的酶聯免疫測定方法，其特征在于：所述包被液：碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，pH9.6；洗滌液：磷酸鹽緩沖液，pH7.3；封閉液：含1%BSA的磷酸鹽緩沖液；抗體稀釋液：磷酸鹽緩沖液，pH7.3；終止液：1M?鹽酸。