[發明專利]一種治療風濕性關節炎的膠原蛋白制備方法

無效

• 申請號: 201310013053.2
• 申請日: 2013-01-15
• 公開（公告）號: CN103060415A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 曹榮軍;任憲君;武鑫;劉少芳;張秋艷;金海明;姚秀芬;臺文靜
• 申請（專利權）人: 青島貝爾特生物科技有限公司
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K1/18;A61P19/02;A61P29/00
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技術領域

本發明涉及一種膠原蛋白制備方法，尤其涉及一種治療風濕性關節炎的膠原蛋白制備方法。

背景技術

風濕性關節炎（rheumatoid?arthritis）是一種常見的急性或慢性結締組織炎癥。屬變態反應性疾病，是風濕熱的主要表現形式之一。多以急性發熱及關節疼痛起病，典型表現是輕度或中度發熱，游走性多關節炎，受累關節多為膝、踝、肩、肘、腕等大關節，常見由一個關節轉移至另一個關節，病變局部呈現紅、腫、灼熱、劇痛，部分病人也有幾個關節同時發病，不典型的病人僅有關節疼痛而無其他炎癥表現，急性炎癥一般于2-4周消退，不留后遺癥，但常反復發作。若風濕活動影響心臟，則可發生心肌炎，甚至遺留心臟瓣膜病變。?風濕性關節炎的病因尚未完全明了。根據癥狀、流行病學及免疫學的資計分析，認為與人體溶血性鏈球菌感染密切相關，目前注意到病毒感染與本病也有一定關系。

目前治療的方式主要有五種：一、中醫推拿：能對風濕病癥狀的緩解起到輔助作用，這是風濕性關節炎的中醫治療方法；二、藥物治療：藥物治療的原則在于早發現、早診斷、早治療，并能及早合理、聯合用藥；三、外科療法：包括不同的僥幸手術，人工關節的置換、滑膜切除等。手術不能治愈風濕病，只能改善關節功能和生活的能力；四、物理、康復、職業訓練、心理等其它的治療方法，是風濕性關節炎的中醫治療方法；五、膏藥治療：使用膏藥外治法，針對性給藥，使藥效得到充分吸收，從而實現舒筋活絡，散寒定痛，調肝益腎，通利關節之功效，達到治愈風濕性關節炎的目的。

Ⅱ型膠原蛋白存在于軟骨等組織中，口服同種屬或異種屬Ⅱ型膠原蛋白均有抑制、減輕動物模型關節炎和人類風濕性關節炎(RA）的作用，是一種很好的藥物治療成分，但現有的制備方法所制備的Ⅱ型膠原蛋白，蛋白質含量低，分子量大，不能滿足醫藥需要，因此，需要一種提高蛋白質的含量，降低分子量的制備方法來滿足醫藥工業需要。

發明內容

為了解決現有技術中的問題，本發明的目的是提供一種治療風濕性關節炎的膠原蛋白制備方法。

為達到上述目的，本發明所采用的技術手段是：一種治療風濕性關節炎的膠原蛋白制備方法，其制備步驟如下：

一、除雜：取定量新鮮動物軟骨，剝去骨膜，置于液氮下冷凍，再磨成粉末，將軟骨粉末置于容器中，加入其質量15倍體積的鹽酸胍-Tris-HCl緩沖液，于4?℃下攪拌處理16h，鹽酸胍-Tris-HCl緩沖液中鹽酸肌的濃度為6mol/L?,?Tris濃度為0.1mmol/L,?pH值為7.5?；

二、提?。禾幚硗瓿珊笥美鋬鲭x心機離心30min，轉速設置8000r/min，收集沉淀，用0.6mmol/L乙酸充分洗滌，然后加入其質量5倍體積的0.6mmol/L乙酸，內含1.5g/L胃蛋白酶懸浮，于4℃下攪拌水解36h?；

三、分離：水解完成后，以12000r/min離心處理30min，收集上層清液，用2mmol/L?的NaCl鹽析24h，離心，收集沉淀用0.2mmol/L乙酸溶解后裝入透析袋，用緩沖液進行透析溶解，緩沖液濃度及組成為?0.1mmol/L?Tris-HCl-0.4mmol/L?NaCl?，pH=7.4，此透析溶解液即為粗Ⅱ型膠原蛋白；

四、純化：將大孔離子交換樹脂NKA-9經0.1mmol/L?Tris-HCl和0.4mmol/L?NaCl?，pH=7.4平衡后，裝入交換柱內，控制樹脂柱徑高比≥5，緩緩加入經平衡液透析后的粗Ⅱ型膠原蛋白，調節過柱流速為每小時3～4倍樹脂體積，用核酸蛋白檢測儀于280nm監測流出液的第一個吸收峰，收集有吸收峰的流出液；

五、脫鹽干燥：向流出液中加入2mmol/L?NaCl?溶液，鹽析Ⅱ型膠原蛋白，于4℃下沉淀10-12h，用冷凍離心機離心20min，轉速設置8000r/min，收集沉淀用0.6mmol/L乙酸重新溶解，裝入透析袋中，對水透析過夜，最后冷凍干燥，獲得純化Ⅱ型膠原蛋白。

進一步的，所述步驟五中所得的純化Ⅱ型膠原蛋白為白色粉末，蛋白質含量≥94％，平均分子量400-800道爾頓。

本發明的有益效果在于：通過本方法制備了高純度的能用于治療風濕性關節炎的膠原蛋白，蛋白質含量≥94％，平均分子量400-800道爾頓，且制備方法簡便，利于規模生產。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，以助于理解本發明的內容。

實施例1

一種治療風濕性關節炎的膠原蛋白制備方法，其制備步驟如下：