[發(fā)明專利]一種治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的膠原蛋白制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310013053.2
• 申請日: 2013-01-15
• 公開（公告）號: CN103060415A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曹榮軍;任憲君;武鑫;劉少芳;張秋艷;金海明;姚秀芬;臺文靜
• 申請（專利權(quán)）人: 青島貝爾特生物科技有限公司
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K1/18;A61P19/02;A61P29/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的膠原蛋白制備方法，其特征在于，制備步驟如下：

一、除雜：取定量新鮮動物軟骨，剝?nèi)ス悄?，置于液氮下冷凍，再磨成粉末，將軟骨粉末置于容器中，加入其質(zhì)量15倍體積的鹽酸胍-Tris-HCl緩沖液，于4?℃下攪拌處理16h，鹽酸胍-Tris-HCl緩沖液中鹽酸肌的濃度為6mol/L?,?Tris濃度為0.1mmol/L,?pH值為7.5?；

二、提取：處理完成后用冷凍離心機離心30min，轉(zhuǎn)速設(shè)置8000r/min，收集沉淀，用0.6mmol/L乙酸充分洗滌，然后加入其質(zhì)量5倍體積的0.6mmol/L乙酸，內(nèi)含1.5g/L胃蛋白酶懸浮，于4℃下攪拌水解36h?；

三、分離：水解完成后，以12000r/min離心處理30min，收集上層清液，用2mmol/L?的NaCl鹽析24h，離心，收集沉淀用0.2mmol/L乙酸溶解后裝入透析袋，用緩沖液進行透析溶解，緩沖液濃度及組成為?0.1mmol/L?Tris-HCl-0.4mmol/L?NaCl?，pH=7.4，此透析溶解液即為粗Ⅱ型膠原蛋白；

四、純化：將大孔離子交換樹脂NKA-9經(jīng)0.1mmol/L?Tris-HCl和0.4mmol/L?NaCl?，pH=7.4平衡后，裝入交換柱內(nèi)，控制樹脂柱徑高比≥5，緩緩加入經(jīng)平衡液透析后的粗Ⅱ型膠原蛋白，調(diào)節(jié)過柱流速為每小時3～4倍樹脂體積，用核酸蛋白檢測儀于280nm監(jiān)測流出液的第一個吸收峰，收集有吸收峰的流出液；

五、脫鹽干燥：向流出液中加入2mmol/L?NaCl?溶液，鹽析Ⅱ型膠原蛋白，于4℃下沉淀10-12h，用冷凍離心機離心20min，轉(zhuǎn)速設(shè)置8000r/min，收集沉淀用0.6mmol/L乙酸重新溶解，裝入透析袋中，對水透析過夜，最后冷凍干燥，獲得純化Ⅱ型膠原蛋白。

2.根據(jù)權(quán)力要求1所述的治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的膠原蛋白制備方法，其特征在于：所述步驟五中所得的純化Ⅱ型膠原蛋白為白色粉末，蛋白質(zhì)含量≥94％，平均分子量400-800道爾頓。