[發明專利]成人睪丸支持細胞-胰島復合物及其制備方法

無效

• 申請號: 201310013000.0
• 申請日: 2013-01-15
• 公開（公告）號: CN103054903A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 李楊;薛武軍;丁小明;馮新順;田小輝;田普訓;丁晨光
• 申請（專利權）人: 西安交通大學醫學院第一附屬醫院
• 主分類號: A61K35/48
• 分類號: A61K35/48;A61K35/39;C12N5/071;A61P5/48;A61P37/08
• 代理公司: 暫無信息
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技術領域

本發明設計一種成人胰島移植復合物的制備方法。

背景技術

胰島移植已經成為最有希望治愈1型糖尿病的方法，供體短缺和移植物丟失限制了其廣泛應用。

胰島分離純化過程中破壞了其內部的微循環系統，導致移植后無法像胰腺移植那樣立即恢復血運，而是需要相當長時間重建血運系統，從而造成的營養缺乏損傷。此外，免疫排斥反應仍是困擾胰島移植臨床廣泛開展的重要問題，采用具有免疫調節功能的細胞誘導胰島移植的免疫耐受成為較理想的方法。

發明內容

睪丸支持細胞（Sertoli?cells）同時具有營養支持和免疫調節功能。在改良成人胰島分離純化的基礎上，采用睪丸支持細胞包被體外構建胰島-睪丸支持細胞復合物，利用睪丸支持細胞營養支持作用，延長胰島體外存活時間，同時利用其免疫調節功能，抑制排斥反應。從減輕胰島缺血缺氧的時間和抑制排斥反應兩個環節上減少胰島移植物的丟失，提高其生存率。????

為了達到上述目的，本發明所采用的技術方案是：

成人睪丸支持細胞-胰島復合物的制備方法，其特征在于，包含如下步驟，

睪丸支持細胞的分離純化：采用兩步消化法分離純化睪丸支持細胞；

成人胰島的分離純化：采用半自動灌注過濾法用1.5?g/L的膠原酶Ⅴ，本處可以參考李楊、薛武軍、宋煥瑾等.成人睪丸支持細胞分離方法的建立及在胰島移植中的應用.細胞與分析免疫學雜志，2010，26（6）：552-559；消化胰腺，采用自動細胞淘洗儀（型號：Cobe2991），通過連續密度梯度離心的方法進行胰島的純化，分離和純化的胰島懸浮于含100?ml/L胎牛血清的RPMI-1640培養基，于37℃、50?ml/L?CO₂?培養箱中培養；

睪丸支持細胞-胰島復合物的建立：首先將睪丸支持細胞消化，采用PKH-67對其進行標記；紅色熒光細胞表面交聯劑（PKH-26）標記的睪丸支持細胞與胰島混合成細胞懸液0.5毫升，置于細胞細胞培養管培養2小時，隨后轉移肝素處理的低吸附培養皿中，加入含100?g/L?胎牛血清的RPMI1640培養基3?ml培養，使睪丸支持細胞附著于胰島表面。

本發明進一步技術方案在于在于，所述步驟睪丸支持細胞的分離純化的兩步消化法為，第一步2.5?g/L?胰蛋白酶、0.4?g/L?DNA酶I，本處可以參考李楊、薛武軍、宋煥瑾等.成人睪丸支持細胞分離方法的建立及在胰島移植中的應用.細胞與分析免疫學雜志，2010，26（6）：552-559；于37℃消化30min，第二步5?g/L、1?g/L?透明質酸酶37℃消化20min；將消化好的細胞接種于50ml的細胞培養瓶中，于39℃、5%?CO₂培養箱中培養24小時，用20mmol/L?三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液（pH7.2）對細胞進行2.5?min的低滲處理，DMEM/F12培養基洗滌3次，最后采用含100?g/L?FBS的RPMI1640的培養基于37℃、50?mL/L?CO₂培養箱中培養。

本發明進一步技術方案在于在于，包含如下步驟，

睪丸支持細胞的分離純化；用4℃的Hank’s液沖洗睪丸，去除被膜及血管，置于2.5?g/L?胰蛋白酶、0.4?g/L?DNA酶I于37℃恒溫水浴箱消化30?min，含100?mL/L胎牛血清的DMEM/F12培養基終止消化，離心去上清，5?g/L?膠原酶Ⅴ、1?g/L?透明質酸酶于37℃恒溫水浴箱中消化20?min，含100?mL/L?胎牛血清的DMEM/F12培養基終止消化，100目的篩網過濾后，無血清DMEM/F12培養基洗滌3次后，離心去上清，所得的沉淀物均重懸于含200?mL/L胎牛血清的DMEM/F12培養基中,?于39℃、50?mL/L?CO₂培養箱中孵育48小時，更換培養液,?于39℃、50?mL/L?CO₂繼續孵育8小時后,?更換無血清的培養液，20?mmol/L的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH?7.?0)對細胞進行5?min的低滲處理,?最后采用含100?g/L?FBS的RPMI1640的培養基于37℃、50?mL/L?CO₂培養箱中培養，隔天換液，在睪丸支持細胞培養過程中于倒置顯微鏡鏡下觀察計算細胞數量，取細胞制作細胞爬片，經波形蛋白免疫組化染色，通過觀察波形蛋白表達鑒定睪丸支持細胞；