[發明專利]成人睪丸支持細胞-胰島復合物及其制備方法

無效

• 申請號: 201310013000.0
• 申請日: 2013-01-15
• 公開（公告）號: CN103054903A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 李楊;薛武軍;丁小明;馮新順;田小輝;田普訓;丁晨光
• 申請（專利權）人: 西安交通大學醫學院第一附屬醫院
• 主分類號: A61K35/48
• 分類號: A61K35/48;A61K35/39;C12N5/071;A61P5/48;A61P37/08
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.?成人睪丸支持細胞-胰島復合物的制備方法，其特征在于，包含如下步驟，

睪丸支持細胞的分離純化：采用兩步消化法分離純化睪丸支持細胞；

成人胰島的分離純化：采用半自動灌注過濾法用1.5?g/L的膠原酶Ⅴ，消化胰腺，采用自動細胞淘洗儀（型號：Cobe2991），通過連續密度梯度離心的方法進行胰島的純化，分離和純化的胰島懸浮于含100?ml/L胎牛血清的RPMI-1640培養基，于37℃、50?ml/L?CO₂?培養箱中培養；

睪丸支持細胞-胰島復合物的建立：首先將睪丸支持細胞消化，采用PKH-67對其進行標記；紅色熒光細胞表面交聯劑（PKH-26）標記的睪丸支持細胞與胰島混合成細胞懸液0.5毫升，置于細胞細胞培養管培養2小時，隨后轉移肝素處理的低吸附培養皿中，加入含100?g/L?胎牛血清的RPMI1640培養基3?ml培養，使睪丸支持細胞附著于胰島表面。

2.?如權利要求1所述的成人睪丸支持細胞-胰島復合物的制備方法，其特征在于，所述步驟睪丸支持細胞的分離純化的兩步消化法為，第一步2.5?g/L?胰蛋白酶、0.4?g/L?DNA酶I，于37℃消化30min，第二步5?g/L?膠原酶Ⅴ、1?g/L?透明質酸酶37℃消化20min；將消化好的細胞接種于50ml的細胞培養瓶中，于39℃、5%?CO₂培養箱中培養24小時，用20mmol/L?三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液（pH7.2）對細胞進行2.5?min的低滲處理，DMEM/F12培養基洗滌3次，最后采用含100?g/L?FBS的RPMI1640的培養基于37℃、50?mL/L?CO₂培養箱中培養。

3.?如權利要求1所述的成人睪丸支持細胞-胰島復合物的制備方法，其特征在于，包含如下步驟，

睪丸支持細胞的分離純化；用4℃的Hank’s液沖洗睪丸，去除被膜及血管，置于2.5?g/L?胰蛋白酶、0.4?g/L?DNA酶I于37℃恒溫水浴箱消化30?min，含100?mL/L胎牛血清的DMEM/F12培養基終止消化，離心去上清，5?g/L?膠原酶Ⅴ、1?g/L?透明質酸酶于37℃恒溫水浴箱中消化20?min，含100?mL/L?胎牛血清的DMEM/F12培養基終止消化，100目的篩網過濾后，無血清DMEM/F12培養基洗滌3次后，離心去上清，所得的沉淀物均重懸于含200?mL/L胎牛血清的DMEM/F12培養基中,?于39℃、50?mL/L?CO₂培養箱中孵育48小時，更換培養液,?于39℃、50?mL/L?CO₂繼續孵育8小時后,?更換無血清的培養液，20?mmol/L的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH?7.?0)對細胞進行5?min的低滲處理,?最后采用含100?g/L?FBS的RPMI1640的培養基于37℃、50?mL/L?CO₂培養箱中培養，隔天換液，在睪丸支持細胞培養過程中于倒置顯微鏡鏡下觀察計算細胞數量，取細胞制作細胞爬片，經波形蛋白免疫組化染色，通過觀察波形蛋白表達鑒定睪丸支持細胞；

成人胰島的分離純化；成人胰腺采用冷凝系統將消化液降至4℃，以150?mLmin的流量連續灌注10?min，然后將采用熱交換器，將管路溫度上升至34℃，以150?ml/min的流量連續灌注5?min，灌注消化液配方：1.5?mg/L膠原酶NB1消化液含有共3.5萬U的烏司他丁和2000?U的DNA酶I共350?ml；胰腺消化：將胰腺放入消化罐中，上下分別接硅膠管形成循環的環路，保持溫度迅速提升并穩定在34℃，開始消化胰腺，自消化開始8min時，每min吸取1?ml消化系統中的液體，滴入DTZ染色于顯微鏡下觀察胰島游離的情況和腺泡松散的程度，且觀察到50%的游離胰島時，可終止消化；胰島收集：迅速降低循環系統中消化液的溫度，接取流出的消化液，以1L為一瓶，每一瓶添加不同量的稀釋液和胎牛血清，接取的消化液也不相同，觀察出口端流出的液體，待其變的清涼后，停止補充液體，將收集到的液體分裝至無菌的250?ml離心管，并放至低溫離心機中于4℃，140?g離心1?min，取出小心棄去上清液，再加入胰島洗滌液后，輕微震蕩均勻后在進行上述離心，反復洗滌三次；胰島純化：洗滌收集的胰島組首先溶解在UW器官保存混勻放置30?min以上，將最終收集的組織離心后棄去上清，沉淀物分成20?ml的等份，每一份加入UW液，定容至200?ml，啟動Cobe2991細胞淘洗儀，依次導入密度為1.100?的淋巴細胞分離液液130ml、130?ml，密度為1.070的淋巴細胞分離液130毫升、燒杯中導入胰島/UW混合液，使其充分混勻，離心5?min，依次收集8瓶產物，棄去上清液，用冰洗滌液，4?℃，280?g離心1?min，重復2遍，洗滌期間可根據取樣檢測結果，將純度相近的離心管合并，分離純化的胰島大約每20000?胰島當量（IEQ）的胰島飼養于1個面積為175?cm²的細胞培養瓶，添加30?ml?CMRL1066培養基，培養條件均為于37℃、5%的CO₂，每日全量更換培養基；胰島觀察：在胰島培養過程中的吸出少量胰島懸濁液置于培養皿中，經DTZ染色后，倒置顯微鏡鏡下觀察計算胰島數量，經AO-PI染色經熒光顯微鏡下觀察，計算胰島活性；

睪丸支持細胞-胰島復合物的建立：將培養的睪丸支持細胞用2.5?g/L胰酶（含0.2?g/L乙二胺四乙酸）消化，用含100?g/L小牛血清的DMEM/F12培養基終止消化收集2×10⁷睪丸支持細胞，PBS洗一遍，然后1000?r/min離心5?min，棄去上清液，加入1?ml?PKH-67試劑盒中的緩沖液重懸細胞，另取1ml緩沖液稀釋0.4?μl熒光標記液，1?ml細胞懸液與1?ml熒光標記液混合，吹打均勻，于25℃下顛倒混勻2-5min，加入小牛血清2?ml終止標記，混勻放置1?min，再加4?ml?RPMI-1640培養基，混勻后1000?r/min離心10?min，更換離心管，10?ml培養液洗滌3次，每次10?min，最后將細胞懸液接種于培養瓶內培養，將分離純化收集的1000?IEQ胰島和5×10⁵的PKH-26標記睪丸支持細胞加入肝素處理的4?ml細胞培養管內，加入不超過0.5?ml?RPMI1640培養基（含100?g/L?FBS）中制成懸濁液，然后在37℃中共同孵育2?hr，孵育期間將胰島與睪丸支持細胞輕輕混合一次，然后移至低吸附預處理的6孔板中，加入含100?g/L?FBS的RPMI1640培養基3?ml繼續培養，培養過程中經DTZ染色，于倒置像差顯微鏡下觀察復合物構建情況，收集復合物經胰島素-波形蛋白免疫組化雙染，通過觀察波胰島素和形蛋白染色分布鑒定睪丸支持細胞是否附著于胰島表面構成復合物。

4.?成人睪丸支持細胞-胰島復合物，其特征在于，該復合物含有睪丸支持細胞，它與胰島細胞共培養后，結合于胰島細胞表面，與胰島細胞形成復合物，該復合物的形態學特征是胰島表面結合有大量多角形、有突起的睪丸支持細胞，該復合物既有分泌胰島素的功能，同時具有分泌營養支持和免疫調節細胞因子的功能。