[發(fā)明專利]一種同時(shí)提取和檢測(cè)生物介質(zhì)中多種激素及其代謝物的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310012814.2
• 申請(qǐng)日: 2013-01-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103336065A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-10-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄧慧華;陳崝;張靜;李季峰;陸祖宏
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東南大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 柏尚春

1.一種同時(shí)提取和檢測(cè)生物介質(zhì)中多種激素及其代謝物的方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）樣品的采集：采集檢測(cè)目標(biāo)的生物流體介質(zhì)和生物固體介質(zhì)；

（2）樣品的前處理以及樣品中目標(biāo)物的提取：

（2.1）對(duì)生物流體介質(zhì)的前處理和目標(biāo)物提取：取100～500μl生物流體介質(zhì)，在生物流體介質(zhì)中加入100～500μl0.05～0.2mol/l的高氯酸以及含1～50ng內(nèi)標(biāo)物的內(nèi)標(biāo)溶液，然后用水將流體樣品稀釋5～10倍，再加入2～5ml有機(jī)溶劑，渦旋震蕩2～10min后在離心機(jī)中進(jìn)行萃取，取上清有機(jī)相；

（2.2）對(duì)生物固體介質(zhì)的前處理和目標(biāo)物提取：取5～500mg生物固定介質(zhì)在室溫下用0.1～5ml小分子有機(jī)溶劑，清洗2～5次，每次1～10min，風(fēng)干；然后加入1～3ml的甲醇以及含1～50ng內(nèi)標(biāo)物的內(nèi)標(biāo)溶液，在20～60℃條件下孵化10～72h，再將孵化后的溶液離心，取上清液；

（3）生物流體介質(zhì)以及生物固體介質(zhì)中目標(biāo)物的萃取和檢測(cè)：

（3.1）生物流體介質(zhì)中目標(biāo)物的萃取和檢測(cè)：將步驟（2.1）中所取的上清有機(jī)溶液注入到固相萃取柱中，待流干后用1～30ml的去離子水沖洗，然后干燥5～60min，再用100～2000μl的甲醇洗脫；最后將所得到的洗脫液中的溶劑蒸發(fā)，再重新用30～100μl的甲醇溶解，然后將其用高效液相色譜進(jìn)行分離，并使用質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，并用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量；

（3.2）生物固體介質(zhì)中目標(biāo)物的萃取和檢測(cè)：將步驟（2.2）中孵化后所取的上清液注入到固相萃取柱中，待流干后用1～30ml的去離子水沖洗，然后干燥5～60min，再用100～2000μl的甲醇洗脫；最后將所得到的洗脫液中的溶劑蒸發(fā)，再重新用30～100μl的甲醇溶解，然后將其用高效液相色譜進(jìn)行分離，并使用質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，并用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。

2.權(quán)利要求1所述的同時(shí)提取和檢測(cè)生物介質(zhì)中多種激素及其代謝物的方法，其特征在于：所述步驟（1）中的生物流體介質(zhì)包括血液、尿液和唾液中的一種或者多種。

3.權(quán)利要求1所述的同時(shí)提取和檢測(cè)生物介質(zhì)中多種激素及其代謝物的方法，其特征在于：所述步驟（1）中的生物固體介質(zhì)包括毛發(fā)和指甲中的一種或者兩種。

4.權(quán)利要求1所述的同時(shí)提取和檢測(cè)生物介質(zhì)中多種激素及其代謝物的方法，其特征在于：所述步驟（2）中的目標(biāo)物包括皮質(zhì)醇、可的松、睪酮、黃體酮、脫氫表雄酮和脫氫表雄酮硫酸酯中的一種或者多種。

5.權(quán)利要求1所述的同時(shí)提取和檢測(cè)生物介質(zhì)中多種激素及其代謝物的方法，其特征在于：所述步驟（2.1）中有機(jī)溶劑包括乙酸乙酯和二氯甲烷中的一種或者兩種，所述步驟（2.2）中的小分子有機(jī)溶劑為甲醇、異丙烷、正辛烷中的一種或者多種。

6.權(quán)利要求1所述的同時(shí)提取和檢測(cè)生物介質(zhì)中多種激素及其代謝物的方法，其特征在于：所述步驟（2.1）中離心機(jī)進(jìn)行離心時(shí)，以5000～12000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心5～10min，靜置5～10min。

7.權(quán)利要求1或者3所述的同時(shí)提取和檢測(cè)生物介質(zhì)中多種激素及其代謝物的方法，其特征在于：所述步驟（2.2）中清洗完畢后，將生物固體介質(zhì)剪碎至0.1～0.5cm的碎片或研磨成150～300目的碎末。

8.權(quán)利要求1所述的同時(shí)提取和檢測(cè)生物介質(zhì)中多種激素及其代謝物的方法，其特征在于：所述步驟（3.1）和（3.2）中使用固相萃取柱前，先用1～10ml的甲醇活化，然后用適量1～30ml的水洗。

9.權(quán)利要求1所述的同時(shí)提取和檢測(cè)生物介質(zhì)中多種激素及其代謝物的方法，其特征在于：所述步驟（2.1）和（2.2）中加入的內(nèi)標(biāo)溶液中內(nèi)標(biāo)物為四氘化皮質(zhì)醇和六氘化脫氫表雄酮的一種或兩種。

10.權(quán)利要求1或者3所述的同時(shí)提取和檢測(cè)生物介質(zhì)中多種激素及其代謝物的方法，其特征在于：所述步驟（3）中高效液相色譜的檢測(cè)條件包括如下：

（1）色譜柱：C18色譜柱；

（2）流動(dòng)相：甲醇：水的體積比為50:50～95:5，其中每100ml流動(dòng)相含0.1～1.0ml甲酸，用0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾，超聲脫氣；

（3）流速：0.2～0.5ml/min；

（4）進(jìn)樣量：2～20μl；

（5）柱溫：25～40℃。