[發(fā)明專利]基于核酸適配體的層析法檢測試劑盒及其制備方法和檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310012751.0
• 申請日: 2013-01-14
• 公開（公告）號(hào): CN103048449A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 譚蔚泓;常榮山;蔣健暉
• 申請（專利權(quán)）人: 譚蔚泓
• 主分類號(hào): G01N33/566
• 分類號(hào): G01N33/566;G01N33/531;G01N33/558
• 代理公司: 長沙正奇專利事務(wù)所有限責(zé)任公司 43113
• 代理人: 馬強(qiáng)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種醫(yī)療檢測產(chǎn)品及其制作方法，尤其涉及一種基于核酸適配體的層析法檢測試劑盒及其制備方法和檢測方法。

背景技術(shù)

普通的免疫檢測法是將特異的標(biāo)記抗體先固定于固相支持物，與待測物特異結(jié)合后，再與另一個(gè)抗體結(jié)合，這樣通過肉眼或特定的檢測儀器，就可以定性檢測待測物，從而實(shí)現(xiàn)特異性的免疫診斷。

常用的免疫層析法所用的特異識(shí)別檢測物的生物大分子都是抗體，通過抗原抗體特異識(shí)別反應(yīng)，標(biāo)記在抗原或抗體上的免疫膠體顆粒使檢測線和質(zhì)控線顯示一定的顏色，從而實(shí)現(xiàn)特異性的免疫診斷。但是該方法檢測不夠快速和靈敏，而且用抗體檢測還需要用到相應(yīng)的儀器設(shè)備，操作不簡便。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，一種基于核酸適配體的層析法檢測試劑盒及其制備方法和檢測方法。通過提供一種能通過核酸適配體特異識(shí)別檢測物，在常規(guī)膠體金免疫層析試劑盒基礎(chǔ)上，制作膠體金免疫層析檢測試劑盒，通過在檢測線和質(zhì)控線上顯色，來實(shí)現(xiàn)檢測。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：

本發(fā)明提供了一種基于核酸適配體的層析法檢測試劑盒，包括檢測試紙；所述檢測試紙包括底板，粘合在底板上且依次搭接的樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊；所述硝酸纖維膜上靠近結(jié)合墊的一側(cè)設(shè)有檢測線，硝酸纖維膜上靠近吸水墊的一側(cè)設(shè)有質(zhì)控線；所述結(jié)合墊上涂有納米粒子標(biāo)記的A核酸適配體；所述檢測線上涂有B核酸適配體與鏈霉親和素的復(fù)合物；所述質(zhì)控線上涂有鏈霉親和素；所述A核酸適配體與B核酸適配體均為能特異性識(shí)別同一檢測物的被生物素標(biāo)記的核酸適配體；其中，所述納米粒子為納米金、四氧化三鐵或乳膠。

其中，所述A核酸適配體的DNA序列5’端被巰基標(biāo)記，3’端被生物素標(biāo)記；所述B核酸適配體的DNA序列3’端被生物素標(biāo)記。

所述A核酸適配體與B核酸適配體的序列可根據(jù)待檢測物進(jìn)行設(shè)計(jì)和調(diào)整，在本發(fā)明的一種實(shí)施例中所述A核酸適配體的DNA序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述B核酸適配體的DNA序列如SEQ?ID?NO.2所示；在本發(fā)明的另一種實(shí)施例中所述A核酸適配體的DNA序列如SEQ?ID?NO.3所示，所述B核酸適配體的DNA序列如SEQ?ID?NO.4所示；在本發(fā)明的另一種實(shí)施例中所述A核酸適配體的DNA序列如SEQ?ID?NO.5所示，所述B核酸適配體的DNA序列如SEQ?ID?NO.4所示。

所述底板為PVC板；樣品墊的材料為聚醋酸膜；所述結(jié)合墊的材料為玻璃纖維；所述吸水墊為吸水濾紙；所述檢測試紙由硬質(zhì)塑料卡包裝。

本發(fā)明還提供了一種制備上述試劑盒的方法，包括如下步驟：

（1）用納米粒子標(biāo)記A核酸適配體；

（2）將樣品墊放入含有BSA、和吐溫的PBS的樣品墊處理液中浸泡1h以上，烘干備用；

（3）將步驟（1）被納米粒子標(biāo)記的A核酸適配體重新分散與含有蔗糖、BSA和吐溫的PBS緩沖稀釋液中，并噴于結(jié)合墊上，烘干備用；

（4）在硝酸纖維膜上檢測線位置噴點(diǎn)B核酸適配體與鏈霉親和素的復(fù)合物，在質(zhì)控線位置噴點(diǎn)鏈霉親和素，烘干備用；

（5）將樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊依次搭接并粘合于底板上，切成檢測試紙條，將檢測試紙條用硬質(zhì)塑料卡包裝。

其中，所述步驟（1）是用直徑為10—40nm的納米粒子標(biāo)記A核酸適配體；步驟（4）中所述噴點(diǎn)于檢測線位置的B核酸適配體與鏈霉親和素的復(fù)合物是將B核酸適配體濃度為0.5—1.5μM，優(yōu)選1μM的溶液與濃度為0.5—1.5mg/mL，優(yōu)選1mg/mL的鏈霉親和素按體積比1:8—12，優(yōu)選1:10混合制備而成；所述噴點(diǎn)于質(zhì)控線位置的鏈霉親和素是濃度為1.5—2.5mg/mL，優(yōu)選2mg/mL的鏈霉親和素稀釋液。

本發(fā)明還提供了一種基于核酸適配體的檢測方法：

所述方法采用識(shí)別同一檢測物的兩個(gè)核酸適配體，在常規(guī)層析試劑盒基礎(chǔ)上，制作上述層析法檢測試劑盒，通過A核酸適配體和B核酸適配體與待測物特異結(jié)合后在檢測線和質(zhì)控線上顯色來實(shí)現(xiàn)無抗體的層析檢測：若質(zhì)控線不顯色，則測試結(jié)果均無效；若檢測線顯色而質(zhì)控線不顯色也視為無效；若質(zhì)控線和檢測線均顯色，則表示在檢測樣品中有待測物。

下面結(jié)合試劑盒的詳細(xì)制作過程及原理對本發(fā)明作進(jìn)一步說明：

本發(fā)明試劑盒的具體制作過程如下：