[發明專利]基于核酸適配體的層析法檢測試劑盒及其制備方法和檢測方法

有效

• 申請號: 201310012751.0
• 申請日: 2013-01-14
• 公開（公告）號: CN103048449A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發明（設計）人: 譚蔚泓;常榮山;蔣健暉
• 申請（專利權）人: 譚蔚泓
• 主分類號: G01N33/566
• 分類號: G01N33/566;G01N33/531;G01N33/558
• 代理公司: 長沙正奇專利事務所有限責任公司 43113
• 代理人: 馬強

1.一種基于核酸適配體的層析法檢測試劑盒，包括檢測試紙；所述檢測試紙包括底板（1），粘合在底板（1）上且依次搭接的樣品墊（2）、結合墊（3）、硝酸纖維素膜（4）和吸水墊（7）；所述硝酸纖維膜（4）上靠近結合墊（3）的一側設有檢測線（5），硝酸纖維膜（4）上靠近吸水墊（7）的一側設有質控線（6）；其特征在于，所述結合墊（3）上涂有納米粒子標記的A核酸適配體；所述檢測線（5）上涂有B核酸適配體與鏈霉親和素的復合物；所述質控線（6）上涂有鏈霉親和素；所述A核酸適配體與B核酸適配體均為能特異性識別同一檢測物的被生物素標記的核酸適配體；其中，所述納米粒子為納米金、四氧化三鐵或乳膠。

2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述A核酸適配體的DNA序列5’端被巰基標記，3’端被生物素標記；所述B核酸適配體的DNA序列3’端被生物素標記。

3.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述A核酸適配體的DNA序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述B核酸適配體的DNA序列如SEQ?ID?NO.2所示。

4.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述A核酸適配體的DNA序列如SEQ?ID?NO.3所示，所述B核酸適配體的DNA序列如SEQ?ID?NO.4所示。

5.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述A核酸適配體的DNA序列如SEQ?ID?NO.5所示，所述B核酸適配體的DNA序列如SEQ?ID?NO.4所示。

6.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述底板（1）為PVC板；樣品墊（2）的材料為聚醋酸膜；所述結合墊（3）的材料為玻璃纖維；所述吸水墊（7）為吸水濾紙；所述檢測試紙由硬質塑料卡包裝。

7.制備權利要求1至6任一項所述試劑盒的方法，包括如下步驟：

（1）用納米粒子標記A核酸適配體；

（2）將樣品墊放入含有BSA、和吐溫的PBS的樣品墊處理液中浸泡1h以上，烘干備用；

（3）將步驟（1）被納米粒子金標記的A核酸適配體重新分散與含有蔗糖、BSA和吐溫的PBS緩沖稀釋液中，并噴于結合墊上，烘干備用；

（4）在硝酸纖維膜上檢測線位置噴點B核酸適配體與鏈霉親和素的復合物，在質控線位置噴點鏈霉親和素，烘干備用；

（5）將樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊依次搭接并粘合于底板上，切成檢測試紙條，將檢測試紙條用硬質塑料卡包裝。

8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟（1）是用直徑為10-40nm的納米粒子標記A核酸適配體；步驟（4）中所述噴點于檢測線位置的B核酸適配體與鏈霉親和素的復合物是將B核酸適配體濃度為0.5—1.5μM的溶液與濃度為0.5—1.5mg/mL的鏈霉親和素按體積比1:8—12混合制備而成；所述噴點于質控線位置的鏈霉親和素是濃度為1.5—2.5mg/mL的鏈霉親和素稀釋液。

9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，步驟（4）中所述噴點于檢測線位置的B核酸適配體與鏈霉親和素的復合物是將B核酸適配體濃度為1μM的溶液與濃度為1mg/mL的鏈霉親和素按體積比1:10混合制備而成；所述噴點于質控線位置的鏈霉親和素是濃度為2mg/mL的鏈霉親和素稀釋液。

10.一種基于核酸適配體的檢測方法，其特征在于，所述方法采用識別同一檢測物的兩個核酸適配體，在常規層析試劑盒基礎上，制作權利要求1至6任一項所述的層析法檢測試劑盒，通過A核酸適配體和B核酸適配體與待測物特異結合后在檢測線和質控線上顯色來實現無抗體的層析檢測：若質控線不顯色，則測試結果均無效；若檢測線顯色而質控線不顯色也視為無效；若質控線和檢測線均顯色，則表示在檢測樣品中有待測物。