[發明專利]一種通過染色體加倍誘變和篩選小球藻高產新種質的方法

在審

• 申請號: 201310011116.0
• 申請日: 2013-01-14
• 公開（公告）號: CN103060308A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 蔣立科;盧文軒;楊坤
• 申請（專利權）人: 安徽省農業科學院水產研究所;合肥匯科農業科技開發有限公司;盧文軒
• 主分類號: C12N15/01
• 分類號: C12N15/01;C12N1/12;C12R1/89
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本項發明涉及一種通過染色體加倍誘變和篩選小球藻高產新種質的方法，適用于淡水養殖池塘水質凈化和漁業增產。

背景技術

池塘集約化養殖模式下，大量投喂配合飼料，其中的氮磷僅有9.1%?和17.?4%被魚類同化，殘留飼料和魚類排泄物形成水體污染物，危害水生動物生長發育，誘發多種疫病，造成水產品質量下降。如何凈化和回用養殖廢水已成為制約漁業經濟發展的技術瓶頸。

利用小球藻等微藻處理水產養殖廢水，一方面可以凈化污水，另一方面可以獲得有價值的藻類，促進養殖業的可持續發展。蛋白核小球藻（Chlozella?pyrenoidosa）粉粗蛋白含量63%，不僅是一種高效的污水處理物種，也是一種優良的生物餌料資源。Domenico等利用小球藻在光暗循環為14∶10的條件下處理模擬氨氮廢水，發現氮的去除過程主要發生在有光的時段。小球藻去除水體污染物效果的好壞取決于其光合活性，并受控于氮、磷初始濃度、水溫、光強、進水負荷、停留時間等一系列基本參數。雖然小球藻在處理水產養殖廢水中顯示了其優越性并取得了很大進展，但仍然存在一些問題有待解決。其中，選育和改良具有高效凈化能力、營養價值高的新型小球藻藻種是重要的研發方向。

發明內容

本發明旨在提供一種淡水小球藻誘變培育方法，該方法可有效地誘變培育出水質凈化能力強的小球藻高產優勢藻株。

為實現上述目的，本發明提供的一種淡水小球藻誘變培育方法包括以下步驟：

（1）前培養：吸取1ml液體原藻種接種到含30ml?HB-4液體培養基的三角瓶中進行誘變前的活化培養,無菌操作，于27℃±1?℃、?光照強度30001ux、光照周期為12h∶12h條件下光照培養至對數生長期備用。

（2）誘變處理：在HB-4培養液中添加不同濃度秋水仙堿，制成0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%?6個濃度梯度的小球藻誘變培養液，接種原藻種后于溫度27℃±1?℃、140r/min、光照強度3000lux、光照周期12h∶12h條件下，分別培養6?h、12?h、24?h、36?h、48?h、60?h、72?h、84?h、96?h、120h進行誘變處理。

（3）初篩和恢復培養：每一時間水平誘變結束后，離心分離經誘變的藻細胞，接種到HB-4液體培養基，于27℃±1?℃、140～170r/min、光照強度30001ux，光照周期為12h∶12h、通氣條件下進行恢復培養，每隔6h測定OD_530nm值，以OD_530nm峰值出現最早和峰值最大的實驗組為優勢突變組。

（4）復篩和純化培養：運用涂布平板法，將將初篩獲得的小球藻轉接到HB-5固體分離培養基上進行分離培養，挑選色澤濃綠、半徑大的藻株群落，獲得優勢突變型小球藻純藻株，轉接到試管內HB-4固體斜面培養基上純化培養。

（5）性能檢測：經分離篩選的藻株進行下面各項指標的檢測：

①小球藻核及葉綠體DNA含量檢測；

②小球藻葉綠素含量檢測；

③小球藻穩定期藻細胞濃度測定；

④小球藻胞內可溶性蛋白質含量鑒定；

⑤小球藻水質凈化效能鑒定。

附圖說明

以上給出了本發明的一種通過染色體加倍誘變和篩選創造小球藻高產新種質的方法，下面以具體實施方式并結合附圖對本發明作詳細描述。

圖1?小球藻核及葉綠體DNA的流式細胞儀測定結果。

具體實施方式

（1）前培養：吸取1ml液體原藻種接種到含30ml?HB-4（配方見表1和表3）液體培養基的三角瓶中進行誘變前的活化培養，無菌操作，于27℃±1?℃、光照強度30001ux、光照周期為12h∶12h條件下培養至對數生長期備用。

表1?HB-4配方

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表2?HB-5配方

表3?A5配方

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（2）誘變處理：稱取0.10g秋水仙堿于50mL燒杯中，用10mL無菌水溶解，轉入100mL容量瓶中，用無菌水定容至刻度，經搖勻制得秋水仙堿溶液。

秋水仙堿結構簡式：?