[發明專利]一種甘藍型油菜中的水孔蛋白基因及測序方法

無效

• 申請號: 201310008179.0
• 申請日: 2013-01-09
• 公開（公告）號: CN103060339A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 柴靚;蔣梁材;李浩杰;蒲曉斌;張錦芳;蔣俊;崔成;鄭本川
• 申請（專利權）人: 四川省農業科學院作物研究所
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C07K14/415;C12Q1/68
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

技術領域

本發明涉及基因技術領域，尤其涉及一種甘藍型油菜中的水孔蛋白基因及測序方法。

背景技術

水孔蛋白(aquaporin，AQP)是指細胞膜上能選擇性地高效轉運水分子的膜內在蛋白，屬于MIP?(major?intrinsic?protein)超家族。發明水孔蛋白之前，水分子被認為是只能以自由擴散的方式進出細胞的膜結構。但水孔蛋白的發明顛覆了這一觀點，證明了水分子也可以被膜蛋白以主動運輸的方式運送進出膜結構。自1993年從擬南芥中分離得到第一個植物水孔蛋白γ-TIP至今，已在真細菌、古生菌、真菌、動物和植物等多種生物中發明水孔蛋白。通常植物水孔蛋白按定位和屬性不同而分為5?類：①質膜內在蛋白(plasma?membrane?intrinsic?proteins，?PIPs)?位于質膜上；②液泡膜內在蛋白(tonoplast?intrinsic?proteins，?TIPs)?處于液泡膜上；③類Nod26?膜內在蛋白(nodulin?26-like?intrinsic?proteins，NIPs)存在于根瘤菌和豆科植物的共生膜上；④小分子堿性膜內在蛋白(small?and?basic?intrinsic?proteins，SIPs)；⑤以及類GlpF膜內在蛋白(GlpF-like?intrinsic?proteins，GIPs)。

PIP是其中很重要的一類，通常定位在細胞質膜。水孔蛋白PIP調節水分子進出細胞膜，進而進一步改善植物對干旱或者高鹽脅迫的耐受性。甘藍型油菜是我國最重要的油料作物之一，我國的油菜種植面積和總產量位于世界首位。干旱脅迫往往嚴重影響油菜的產量。所以研究甘藍型油菜PIP基因就具有重要的理論和實踐意義。

現在常用的克隆一個新的基因序列的方法有：利用親緣關系近的物種的同源序列設計引物直接PCR，末端快速克隆法（Rapid?amplification?of?cDNA?ends，RACE），化學合成，電子克隆等。關于水控蛋白PIP3基因，在不同的物種中陸續做了不同程度的方向的研究。但是對于甘藍型油菜，中國乃至世界最重要的油料作物之一，其PIP3或類似基因的研究不多見。目前僅在NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/U78297.1）上有擬南芥PIP3（GenBank:?U78297.1）的編碼區核酸序列和相應蛋白質的氨基酸序列。

高等植物水孔蛋白分為5個大類，每個大類下還有若干小類。根據NCBI數據庫已知的4個甘藍型油菜水孔蛋白（GenBank:?AF118383.1，AF118381.1，?EU487188.1和EU487187.1）分析發明，這4個已知的水孔蛋白與BnPIP3-like的核酸序列相似性分別在44.85%-69.94%不等，并且它們分別屬于PIP2或者TIP等類別。油菜內源還有很多類別的水孔蛋白未知，比如與擬南芥PIP3同源的基因就尚未知曉。這就對全面了解水孔蛋白功能以及進化關系的探索和分析留下了障礙和空白。

發明內容

本發明實施例提供一種甘藍型油菜中的水孔蛋白基因及測序方法，旨在解決現有技術只知道擬南芥PIP3（GenBank:?U78297.1）的基因編碼區核酸序列以及相對應的蛋白質的氨基酸序列，其功能正在逐步被驗證。但是甘藍型油菜體內與擬南芥PIP3（GenBank:?U78297.1）相應的同源基因未知的問題。

本發明的一個方面，提出了一種甘藍型油菜中的水孔蛋白基因，包括：（a）序列表中的核酸序列；和（b）序列表中的氨基酸序列。?

本發明的另一個方面，提出了一種甘藍型油菜中的水孔蛋白基因的測序方法，包括以下步驟：A、獲得甘藍型油菜的無菌苗；B、提取所述無菌苗中的總RNA和總cDNA；C、通過聚合酶鏈反應擴增得到的基因全長；D、對所述擴增得到的聚合酶鏈反應產物處理得到大小正確條帶的菌液；E、對所述菌液進行測序，對得到的測序結果進行軟件分析。

優選的，所述步驟A進一步包括：將甘藍型油菜種子經75%乙醇浸泡1分鐘，0.1%升汞浸泡8min消毒處理后，用滅菌水洗3-5次，置于MS固體培養基上；在人工氣候箱內25°C、相對濕度70%以及16小時光照、8小時黑暗的條件下生長。