[發明專利]一種甘藍型油菜中的水孔蛋白基因及測序方法

無效

• 申請號: 201310008179.0
• 申請日: 2013-01-09
• 公開（公告）號: CN103060339A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 柴靚;蔣梁材;李浩杰;蒲曉斌;張錦芳;蔣俊;崔成;鄭本川
• 申請（專利權）人: 四川省農業科學院作物研究所
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C07K14/415;C12Q1/68
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

1.一種甘藍型油菜中的水孔蛋白基因，其特征在于，包括：（a）序列表中的核酸序列；和（b）序列表中的氨基酸序列。

2.一種甘藍型油菜中的水孔蛋白基因的測序方法，包括以下步驟：

A、獲得甘藍型油菜的無菌苗；

B、提取所述無菌苗中的總RNA和總cDNA;

C、通過聚合酶鏈反應擴增得到的基因全長;

D、對所述擴增得到的聚合酶鏈反應產物處理得到大小正確條帶的菌液；

E、對所述菌液進行測序，對得到的測序結果進行軟件分析。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟A進一步包括：

將甘藍型油菜種子經75%乙醇浸泡1分鐘，0.1%升汞浸泡8min消毒處理后，用滅菌水洗3-5次，置于MS固體培養基上；

在人工氣候箱內25°C、相對濕度70%以及16小時光照、8小時黑暗的條件下生長。

4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟B進一步包括：

取萌發后約3周左右的油菜葉片，采用Trizol試劑盒提取總RNA；

所得的總RNA用RNase-free?DNase?I去掉殘余DNA后，再用反轉錄試劑盒生成第一鏈cDNA；

用Oligo(dT)18引物進行反轉錄，經42?°C孵育30?分鐘后，85?°C?加熱5分鐘使酶失活，所得的cDNA在零下20°C保存。

5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟C進一步包括：

聚合酶鏈反應體系按cDNA?1μL、dNTP?2?L、buffer?2μL、上下游引物各1?μL、酶TansTaq-T?0.2?μL以及ddH2O?12.8L的比例混合，；

在95°C下預變性5?分鐘,?反應36個循環；

在95°C?下反應30秒、?53°C下反應?30?秒以及72°C下?反應1.5分鐘；

在72°C下終延伸8?分鐘，4°C下終止反應并保存得到的聚合酶連反應產物。

6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟D進一步包括：

將得到的產物經由2%瓊脂糖凝膠電泳后，回收大小正確的片段，直接連接在T載體pEASY-T1?Simple上，轉化大腸桿菌感受態并涂布LB+Amp固體培養基平板；

37°C隔夜培養后，挑取形狀規則的白斑，于LB+Amp液體培養基中培養并做菌落PCR；

將擴增出大小正確條帶的菌液送交測序；

序列結果DNAman軟件進行分析。

7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，buffer含Mg²⁺。

8.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述上下游引物為：

P-1:5’-ATGTCGAAAGAAGTGAGCGAAGA-3,?

P-2:5’-TCAGTTTGTTGCGTTGCTTCGGA-3。