[發(fā)明專利]一種用于抗癌藥物篩選的細(xì)胞共培養(yǎng)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310008125.4
• 申請日: 2013-01-10
• 公開（公告）號: CN103014118A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 檀軍;郭建軍;魏超;楊佳琪;李剛
• 申請（專利權(quán)）人: 貴州大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 貴陽中新專利商標(biāo)事務(wù)所 52100
• 代理人: 李亮;程新敏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)，尤其是一種用于抗癌藥物篩選的細(xì)胞共培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

全球每年有700多萬人死于癌癥，抗癌藥物一方面可殺滅癌細(xì)胞，促進患者的生理生化機能恢復(fù)正常；但另一方面也可能產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，因此，在抗癌藥物篩選中對其進行臨床前的細(xì)胞毒、細(xì)胞增殖或細(xì)胞凋亡檢測、安全性評價意義重大。

目前大多數(shù)科研人員在96孔板中進行抗癌藥物篩選、細(xì)胞毒、細(xì)胞增殖或細(xì)胞凋亡檢測研究，由于96孔板無法拆卸，癌細(xì)胞的代謝物無法作用于正常細(xì)胞，因此，單獨培養(yǎng)一種細(xì)胞無法考慮到體內(nèi)癌細(xì)胞與正常細(xì)胞代謝物間的相互影響，此發(fā)明中的細(xì)胞共培養(yǎng)方法彌補了這方面的不足。市場上雖有用于細(xì)胞共培養(yǎng)的Transwell培養(yǎng)小室，但其價格昂貴，且無法實現(xiàn)兩種以上貼壁細(xì)胞的共培養(yǎng)，限制了細(xì)胞共培養(yǎng)研究的發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是：提供一種用于抗癌藥物篩選的細(xì)胞共培養(yǎng)方法，它能更好的模擬體內(nèi)生成的微環(huán)境，極大的提高實驗效率，節(jié)省抗癌藥物研發(fā)費用，具有成本低廉、操作簡單、效果可靠的特點。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：用于抗癌藥物篩選的細(xì)胞共培養(yǎng)方法，將酶標(biāo)孔條拆分后放入6孔板中，將體積均為100ul，密度均為2×10⁴個/ml的癌細(xì)胞與正常細(xì)胞分別接種到每個獨立的酶標(biāo)孔中，待所有的細(xì)胞貼壁后，向各酶標(biāo)孔中加入10ul待測藥物，再向6孔板中加入DMEM培養(yǎng)液8ml，使酶標(biāo)孔浸沒在培養(yǎng)液中，共培養(yǎng)48h后，吸盡培養(yǎng)液，采用MTT法、臺盼藍(lán)染色法、CCK-8法、形態(tài)學(xué)觀察法或hoechst染色法進行細(xì)胞毒、細(xì)胞增殖或細(xì)胞凋亡檢測，從而實現(xiàn)抗癌藥物的篩選。

將酶標(biāo)孔條進行拆分前，先將酶標(biāo)孔在質(zhì)量百分比為75%的乙醇中浸泡1.5～2.5h，然后在生物安全柜中風(fēng)機開啟模式下吹1h，再在紫外線下照射1～1.5h。

將酶標(biāo)孔條進行拆分前，在無菌條件下用明膠或100ug/ml多聚左旋賴氨酸包被酶標(biāo)孔。以促進細(xì)胞貼壁。

所述的用明膠包被酶標(biāo)孔具體是指，將明膠溶解在超純水中，配制成0.2g/100ml的明膠溶液，待明膠完全溶解后，在溫度為121℃、壓力為100～110KPA的條件下，滅菌30min，將經(jīng)過高壓滅菌的明膠取出，獲得配制好的明膠；在無菌條件下向每個酶標(biāo)孔中加入15?ul配制好的明膠，將酶標(biāo)孔底全部覆蓋；再將包被了明膠的酶標(biāo)孔放入37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中1個小時后取出，最后用無菌PBS或超純水洗滌兩次，每次100ul，用于下一步接種細(xì)胞實驗。

所述的用多聚賴氨酸包被酶標(biāo)孔具體是指，取分子量為15～30萬的多聚左旋賴氨酸，溶于PBS或超純水中，配成1mg/ml的儲存液，將儲存液過濾后置于-20℃冰箱中儲存，使用時將濃度稀釋至100ug/ml；然后在無菌條件下向每個酶標(biāo)孔中加入15微升100ug/ml的多聚左旋賴氨酸，將酶標(biāo)孔底全部覆蓋，再將包被了多聚左旋賴氨酸的酶標(biāo)孔放入37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中5個小時或過夜后取出，用無菌PBS或超純水洗滌兩次，用于下一步接種細(xì)胞實驗。

所述的無菌PBS是，稱取1.6g氯化鈉、0.04g氯化鉀、0.04g磷酸二氫鉀、0.44g磷酸氫二鈉（分子式帶7個結(jié)合水）或0.588g磷酸氫二鈉（分子式帶12個結(jié)合水），加入超純水，溶解并定容至200ml，高壓滅菌，在4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

所述的共培養(yǎng)是指用胰蛋白酶分別消化收集癌細(xì)胞與正常細(xì)胞，用倒置相差顯微鏡下計數(shù)，分別以2×10⁴個/ml的濃度接種到各酶標(biāo)孔中，每孔100ul，待細(xì)胞貼壁后分別加入10ul待測藥物，并以不加入藥物的有細(xì)胞培養(yǎng)液為無藥對照組，以無細(xì)胞的培養(yǎng)液為空白對照組，放入37℃二氧化碳濃度為5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)

胰酶可采用hyclone公司生產(chǎn)的產(chǎn)品，也可自行配制，配制方法為：稱0.25g胰蛋白酶粉末加入100mlPBS中，4℃過夜，0.22um的濾膜過濾，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>