[發(fā)明專利]一種布拉氏酵母菌表面展示系統(tǒng)及其構(gòu)建方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310007792.0
• 申請日: 2013-01-09
• 公開（公告）號(hào): CN103031329A
• 公開（公告）日: 2013-04-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙孝民;王甜甜;孫慧
• 申請（專利權(quán)）人: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/81
• 分類號(hào): C12N15/81;C12N1/19;C12R1/865
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種蛋白表面展示系統(tǒng)，具體提供了一種能夠表達(dá)展示異源蛋白質(zhì)的布拉氏酵母菌(Saccharomyces?boulardii)表面展示系統(tǒng)及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

布拉氏酵母菌是法國科學(xué)家亨利(Henri?Boulard)于1920從印尼荔枝等水果中分離的一種非致病性酵母菌。自1982年Ducluzeau等首次發(fā)表布拉氏酵母菌作為益生菌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果以來,對布拉氏酵母菌的抗毒止瀉、維持宿主胃腸道微生態(tài)平衡、提高機(jī)體非特異性免疫力的臨床試驗(yàn)和研究越來越多。布拉氏酵母菌現(xiàn)已被公認(rèn)為最為有價(jià)值的益生菌之一，被世界許多國家廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床和畜牧業(yè)生產(chǎn)中。目前，布拉氏酵母菌作為微生態(tài)制劑在歐美等廣泛用于防治兒童和旅行者的各種腹瀉如梭狀芽孢桿菌、霍亂弧菌、輪狀病毒等感染和抗生素引起的腸炎所致的腹瀉。其制劑應(yīng)用于畜牧業(yè)，可有效降低病原菌和有關(guān)毒素的濃度，增強(qiáng)非特異性免疫功能，提高生產(chǎn)性能。作為飼料添加劑的應(yīng)用已得到包括中國、歐盟在內(nèi)的世界許多國家的認(rèn)可。隨著人們對健康和生態(tài)環(huán)境的高度重視及在畜禽養(yǎng)殖中的進(jìn)一步研究，布拉氏酵母菌在醫(yī)學(xué)和畜牧業(yè)中必將有更廣闊的應(yīng)用前景。

然而，對于布拉氏酵母菌的研究，一直以來主要集中在臨床應(yīng)用方面，而針對布拉氏酵母菌的作用機(jī)制，特別是在分子水平上的作用機(jī)制，以及對布拉氏酵母菌的遺傳改造等卻少有研究和報(bào)導(dǎo)。究其原因，主要是因?yàn)槟壳吧袥]有一整套有效的適用于布拉氏酵母菌的分子遺傳學(xué)技術(shù)操作體系。雖然最近的一系列研究表明，布拉氏酵母菌是釀酒酵母的變異株或亞種，然而布拉氏酵母菌也有作一些完全不同于釀酒酵母的生物學(xué)、生理學(xué)、代謝及遺傳學(xué)特性，如不能利用半乳糖作為碳源、第9染色體為3倍體、對低pH和溫度有較高的耐受性、氮缺乏時(shí)可在一定程度上轉(zhuǎn)化成假絲等，特別是布拉氏酵母菌是野生的菌株、雙倍體、無營養(yǎng)缺陷型且不能孢子化。因此，適用于釀酒酵母的技術(shù)體系和方法無法直接應(yīng)用于布拉氏酵母菌。這直接限制了對布拉氏酵母菌進(jìn)行分子生物學(xué)、遺傳學(xué)等方面全面深入的研究，以至于對布拉氏酵母菌從基因水平上進(jìn)行遺傳改的設(shè)想，由于缺乏有效的分子遺傳學(xué)技術(shù)操作體系而無法實(shí)現(xiàn)。

與噬菌體和細(xì)菌表面展示相比，酵母菌表面展示系統(tǒng)具有糖基化作用、蛋白翻譯后折疊與高等真核動(dòng)物類似，更利于高效表達(dá)具有生物活性的復(fù)雜蛋白。此技術(shù)已成功應(yīng)用于篩選特異配體、繪制抗原表位圖譜，生產(chǎn)活菌體疫苗、全細(xì)胞催化劑，和蛋白的定向進(jìn)化等。作為益生菌，布拉氏酵母菌的表面展示系統(tǒng)在國內(nèi)外尚未見任何的研究和報(bào)導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的發(fā)明人針對上述現(xiàn)有技術(shù)的情況，提供了一種以布拉氏酵母菌為表面展示平臺(tái)表達(dá)外源蛋白質(zhì)的表面展示系統(tǒng)，本系統(tǒng)從布拉氏酵母菌，購自法國百科達(dá)制藥廠，進(jìn)口藥品注冊證號(hào)為s20040038，的DNA組中擴(kuò)增得到AGA1基因以及AGA2基因，并以pPIC9AGA2質(zhì)粒為模板擴(kuò)增AGA2基因表達(dá)核,用布拉氏酵母菌的AGA2基因替換AGA2基因表達(dá)核的AGA2基因。將獲得的AGA1基因和替換后的AGA2基因表達(dá)核連接到基礎(chǔ)質(zhì)粒pSP上，分別在超表達(dá)啟動(dòng)子TEF1和PGK1控制之下，由此得到能夠在布拉氏酵母菌表面表達(dá)的通用表面展示表達(dá)質(zhì)粒pSDSb。本發(fā)明能夠持續(xù)表達(dá)和該通用質(zhì)粒pSDSb的Aga2p的C端融合的異源蛋白質(zhì)并展示在布拉氏酵母菌的表面，從而超表達(dá)某些異源蛋白，將其作為病原活疫苗載體和研究蛋白與蛋白之間的相互作用具有其它微生物載體不可取代的作用。

本發(fā)明所提供的系統(tǒng)以pSP為基礎(chǔ)質(zhì)粒構(gòu)建布拉氏酵母菌表面展示通用表達(dá)質(zhì)粒，將AGA1基因的，其基因序列如Seq?ID?No:8所示，AGA2基因表達(dá)核，其基因序列如Seq?ID?No:10所示，克隆到基礎(chǔ)質(zhì)粒pSP上，由此得到能夠在布拉氏酵母菌表面表達(dá)的通用表面展示表達(dá)質(zhì)粒pSDSb。異源蛋白與該通用質(zhì)粒的Aga2p的C端融合從而表面展示在布拉氏酵母菌細(xì)胞壁上。

上述的表達(dá)質(zhì)粒pSDSb轉(zhuǎn)化布拉氏酵母菌后，質(zhì)粒中的Aga1p（AGA1基因表達(dá)的蛋白）通過GPI錨定在細(xì)胞壁上，Aga2p（替換后的AGA2基因表達(dá)核表達(dá)的蛋白）的N端通過兩個(gè)二硫鍵與Aga1p連接，異源蛋白通過與Aga2p的C端融合從而表達(dá)展示在布拉氏酵母菌細(xì)胞壁上。