[發明專利]一種能特異結合河豚毒素的DNA適配子及其應用

有效

• 申請號: 201310007344.0
• 申請日: 2013-01-09
• 公開（公告）號: CN103045602A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發明（設計）人: 邵碧英;楊方;陳文炳;王云才;繆婷玉;彭娟
• 申請（專利權）人: 福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

?本發明具體涉及一種能特異結合河豚毒素的DNA適配子及其應用。

背景技術

河豚毒素（tetrodotoxin，TTX）是毒性最強的非蛋白類神經毒素之一，存在于河豚等多種海洋生物以及蠑螈、火晰蜴、青蛙、蟾蜍等動物體內，某些細菌（如弧菌屬、假單胞菌屬等）也可分泌TTX。TTX的分子式為C₁₁H₁₇N₃O₈，相對分子量為319.271，是一種小分子物質。TTX是鈉離子通道阻斷劑，直接影響神經肌肉興奮性的傳導，使得神經肌肉呈麻痹狀態，甚至引起死亡。河豚毒素性質穩定，可使水源和食物等長期染毒，易經消化道吸收中毒，分散呈氣溶膠狀態的河豚毒素，亦可通過呼吸道吸入中毒。河豚毒素是一種強神經毒素，毒性大大超過包括有機磷毒劑在內的所有合成毒劑，它比氰化鈉的毒性大1000多倍，國內外因食用河豚或織紋螺而導致河豚毒素中毒死亡的案例時有發生。此外，由于TTX已可人工化學合成，存在可能被恐怖分子利用的潛在威脅。這些使得對TTX的檢測越來越被人們所重視。

河豚毒素檢測方法有很多，包括生物法、酶免疫分析法、氣相色譜法、液相色譜法、液相-質譜聯用法等，但目前還未見分子生物學快速篩選檢測方法。

適配子（aptamer）是通過指數富集配基的系統進化（systematic?evolution?of?ligands?by?exponential?enrichment，SELEX）技術從人工合成的DNA或RNA隨機庫中篩選出來的，與非核酸靶物質特異結合的高親和性單鏈寡核苷酸序列。SELEX技術是利用分子生物學技術，人工合成單鏈隨機寡核苷酸文庫（20－60個堿基），將隨機寡核苷酸文庫與靶物質相互作用，保留結合的寡核苷酸序列，經反復擴增、篩選，即可使與該靶物質特異結合的寡核苷酸序列得到富集。SELEX技術發展非常迅速，已成功應用于許多靶物質如蛋白質、肽、病毒、細菌、有機物，甚至金屬離子等的適配子的篩選。適配子包括DNA適配子和RNA適配子，DNA適配子的穩定性較好。適配子與靶物質的結合是由適配子的三維結構通過氫鍵、范德華力等與靶物質的特定區域結合的。適配子具有親和力高、特異性強、靶物質范圍廣、制備及修飾容易、穩定性好、與靶物質的結合條件可調控、應用靈活等特點，在分子生物學、環境檢測、食品衛生檢驗、生物毒素檢測、毒理學等研究領域都有廣闊的應用前景，凡是涉及抗體的診斷領域幾乎都可以用適配子代替，且優于抗體。

因此，本發明以河豚毒素為靶物質，采用SELEX技術，結合克隆、測序、親和力測定等方法制備了能特異結合河豚毒素的DNA適配子，并建立了河豚毒素的DNA適配子-染料直接檢測法，將制備的DNA適配子應用于河豚毒素的分子生物學檢測，達到簡便、快遞篩選河豚毒素的目的。

發明內容

為了提供一種分子生物學快速篩選檢測河豚毒素的方法，本發明提供了一種能特異結合河豚毒素的DNA適配子，并建立一種簡便、快速篩選檢測河豚毒素的DNA適配子-染料直接法。

本發明提供了一種DNA適配子，所述適配子是應用SELEX技術，從人工合成的全長為78個堿基的ssDNA文庫中篩選獲得的單鏈DNA（ssDNA），能特異結合河豚毒素。

所述DNA適配子的核苷酸序列為（SEQ?ID?NO.1）：

5‘-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAACCCTGCCGGGGGCTTCTCCTTGCTGCTCTGCTCTGTTCGACATGAGGCCCGGATC-3‘。

本發明另外還提供了上述DNA適配子的應用，是將所述DNA適配子用于篩選檢測河豚毒素。

所述DNA適配子用于篩選檢測河豚毒素是采用DNA適配子-染料法，其能在2小時內快速篩選檢測河豚毒素。

所述DNA適配子-染料法的具體步驟如下：

????取5μL濃度為10pmol/L的DNA適配子的dsDNA于1.5mL離心管中，加入589μL?pH7.5的0.01mol/L磷酸緩沖液，再加入6μL河豚毒素待測樣品，同時以1%乙酸溶液代替河豚毒素待測樣品作為空白對照，室溫下孵育lh。孵育結束后，取孵育后的溶液198μL于酶標微孔中，同時以0.01mol/L磷酸緩沖液作為背景信號對照，各加入2μL染料Eva?Green，充分結合10min后，用多功能酶標儀于激發波長為485nm、發射波長為533nm處測定熒光強度值，當對照溶液與待測樣品的熒光差值大于背景信號時，可判定為河豚毒素初篩陽性。