[發明專利]一種檢測脂肪酶酶活的納米金比色法

有效

• 申請號: 201310007340.2
• 申請日: 2013-01-09
• 公開（公告）號: CN103076326A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發明（設計）人: 田丹碧;宋榮斌;黃和;江凌;鄒冰花
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78;G01N21/33
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務所 32230
• 代理人: 徐蓓

技術領域

本發明屬于分析化學領域，具體涉及一種使用納米金作為信號元件，在水溶液中吐溫即作為脂肪酶的底物又作為納米金穩定劑的檢測脂肪酶酶活的化學比色法。

背景技術

脂肪酶（lipase?E.?C.?3.?1.?1.?3）是一類具有多種催化功能的酶，主要催化三酰甘油酯及其它一些不溶性酯類的水解、醇解、酯化、轉酯化及酯類的逆向合成反應，還具有水解外消旋混合物以及酯和肽鍵合成的能力．脂肪酶已廣泛應用于食品、化工、醫藥合成等諸多領域。隨著脂肪酶的應用領域日漸拓寬、市場規模逐步擴大，脂肪酶檢測也日益重要。

脂肪酶水解活性的測定方法主要有p-NPP法和恒電位自動滴定法。使用的底物主要有三油酸甘油酯、三丁酸甘油酯和橄欖油。但這些底物存在制備麻煩?，需要加入乳化劑乳化，加入的乳化劑會影響酶活的測定，且有pH范圍的限制，p-NPP法雖然操作簡單，但是p-NPP試劑價格昂貴，且靈敏度不足的缺點。

納米金顆粒是指粒徑在1~100納米之間的金顆粒。常以金顆粒分散在水中所形成的金溶膠進行應用，故又稱膠體金或金溶膠。近年來，納米金顆粒作為一種新型的材料，憑借其獨特的物理化學特性，如高比表面積、高表面反應活性、強吸附性等，在材料科學、臨床醫學、生命科學等領域均獲得廣泛的應用。13納米直徑的金顆粒的吸光系數為2.7?×?108?M^-1?cm^-1，比傳統的有機發色團大了3個數量級。另外，分散在溶液中的納米金在互相聚集之后，顏色會從紅色變成藍色。因此，在比色分析法中，納米金是一種理想的顏色信號元件。

現有技術未公開以納米金作為顏色信號元件對脂肪酶的活性進行檢測的技術方案。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于檢測脂肪酶的簡單廉價有效的比色分析法。此方法首次將納米金比色法與脂肪酶天然底物結合，用于檢測其酶活，具體使用吐溫作為脂肪酶的特異性底物，納米金作為信號元件。

本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：

一種檢測脂肪酶酶活的納米金比色法，使用納米金作為信號元件，同時以吐溫作為脂肪酶的底物兼納米金穩定劑。

更確切地，本發明所述的方法具體包括如下步驟：

(1)采用檸檬酸鈉還原氯金酸制得酒紅色納米金溶液，

(2)向步驟（1）中得到的納米金溶液中加入吐溫溶液對納米金進行修飾；

(3)向修飾后的納米金溶液中加入氯化鈉溶液，使得經吐溫穩定的納米金處在鹽溶液中；

(4)向步驟（3）中得到的納米金溶液加入緩沖溶液進行pH的調節；后加入待測脂肪酶溶液，混勻，調節反應溫度，使納米金表面的吐溫被脂肪酶水解，納米金重新暴露到鹽溶液中發生聚集，檢測溶液的紫外可見光譜，得到不同時間對應的紫外可見光譜，然后以吸光度比值E₆₂₀/E₅₂₀作為縱坐標，時間為橫坐標，繪制脂肪酶酶活的動力學曲線。

本發明所述的方法，所述步驟（1）中檸檬酸鈉還原法制備的納米金溶液的濃度為1.8-2.5?nmol/L，納米金的粒徑為13±2?nm。優選納米金溶液的濃度為2?nmol/L，納米金的粒徑為13?nm。

具體納米金溶液的制備可以采用現有技術公開的制備方法，如中國申請201110052259.7所公開的，本發明對此不作特別限定。

其中，所述步驟（2）中吐溫溶液的濃度為3-6?mmol/L，吐溫溶液與納米金溶液的體積比為1:100-1:50，優選1:100。步驟（2）中修飾時間為10-60?min，優選30min。

其中，所述步驟（3）修飾后的納米金溶液中，氯化鈉的最終濃度為0.02-0.1mol/L，優選0.1?mol/L。

本發明所述的檢測脂肪酶酶活的納米金比色法，步驟（4）所述的緩沖液為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液，該緩沖液的濃度及具體用量為本領域技術人員所理解和掌握，具體以最終將納米金溶液pH值調至6-8為準，優選6.5。

本發明所述的檢測脂肪酶酶活的納米金比色法，所述步驟（4）中，反應溫度為30-60℃，優選50℃；待測脂肪酶溶液的加入量為納米金溶液體積的1:20-1:5，優選1:20。

更具體地，本發明所述檢測脂肪酶酶活的納米金比色法，包括如下步驟：

(1)采用檸檬酸鈉還原氯金酸制得濃度為1.8-2.5?nmol/L的酒紅色納米金溶液，