[發明專利]K14-VEGF轉基因小鼠模型及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 201310006297.8
• 申請日: 2013-01-08
• 公開（公告）號: CN103045606A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發明（設計）人: 胡晉紅;李紅;孫軍
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/63;A01K67/027;A61K49/00
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 趙青

技術領域

本發明屬于動物模型技術領域，具體涉及一種K14-VEGF轉基因小鼠模型及其構建方法，以及在銀屑病發病機理研究和篩選預防治療銀屑病藥物中的應用。

背景技術

銀屑病動物模型的探索與構建大概經歷了以下三個階段。第一階段，自發動物模型階段。早期由于對疾病病因、發病機制的了解不多，加之實驗條件的限制，人類很難構建皮膚病的動物模型，但是自然界中有一些動物自發地出現疾病某些病理特征，人們則利用這些有限的資源做科學研究。第二階段，人工構建動物模型階段。隨著科學的進步，醫學基礎學科、醫學相關學科也得到相應的發展，尤其是免疫學和分子生物學的迅速發展對皮膚病動物模型的建立起到了巨大的推動作用。此時人們可以根據已有的知識和實驗手段構建粗糙乃至精確的動物模型。20世紀80年代以前，人們主要通過外用、皮下注射某些藥物成分來構建一些比較粗糙的模型。自20世紀80年代起，由于免疫學的發展，將患者皮片移植到免疫缺陷鼠的模型成為研究部分皮膚疾病的有力工具。第三階段，在分子生物學發展的背景下，轉基因動物技術越來越完善成熟。轉基因動物幾乎涉及到皮膚病動物模型的各個領域。人們甚至可以精確地研究某個因子在疾病發生過程中的作用。銀屑病是皮膚科常見病，銀屑病的動物模型也是研究的重點。

轉基因動物是指基因組中整合有外源基因的動物。人們可以運用轉基因技術將外源基因導入體細胞，從而培育出新的動物品系或用于專門研究的動物模型。1990年，Rothnagel率先提出可通過轉基因方法使特異性基因在動物體內表達，而為人類有遺傳傾向的皮膚疾病提供有價值的動物模型。例如，某些細胞因子和生長因子可通過轉因手段在動物體內過度表達，從而產生銀屑病樣反應（參見文獻：Targeting?Gene?Expression?to?the?Epidermis?of?Transgenic?Mice:Potential?Applications?to?Genetic?Skin?Disorders.Journal?of?InvestigativeDermatology(1990)95,59S–61S;doi:10.1111/1523-1747.ep12505805）

血管內皮生長因子(vascular?endothelial?growth?factor，VEGF)是由角蛋白細胞分泌的一種血管內皮細胞特異性有絲分裂原。在多種組織中，促進血管增生；在銀屑病皮損中過度表達加速血管增生，增加內皮細胞上血管的滲透性，引起炎癥細胞的遷移，刺激粘附分子-1（ICAM-1）及內皮細胞粘附分子-1（VCAM-1）的表達（參見文獻：Yu-Ping?Xia,Baosheng?Li,Donna?Hylton,etc.Transgenicdelivery?of?VEGF?to?mouse?skin?lead?to?an?inflammatory?condition?resemblinghuman?psoriasis.Blood2003;102(1):161-168.）。

發明內容

本發明的目的在于提供一種K14-VEGF轉基因小鼠模型，本發明的另一目的是提供該轉基因小鼠模型的構建方法，以及在銀屑病發病機理研究和篩選預防治療銀屑病藥物中的應用。

本發明的技術方案是，利用原核顯微注射技術將包含人類角蛋白14（K14）啟動子和鼠編碼基因VEGF-A164插入到FVB鼠基因組內，由人類角蛋白14（K14）啟動子控制的小鼠VEGF-A164表達，使轉基因鼠表皮基底層過度表達VEGF-A164。

本發明的第一方面，提供了一種K14-VEGF轉基因小鼠模型的構建方法，該構建方法包括以下步驟：

A、PCR擴增attB1-mVEGF164-attB2（如SEQ?ID?NO:1所示）和attB2r-hGH-attB3（如SEQ?ID?NO:2所示），BP（BP?recombination）反應構建中間載體pDown-mVEGF164和pTail-hGH；

B、利用Gateway?Technology（Gateway克隆技術）將pUp-K14、pDown-mVEGF164、pTail-hGH與常規質粒pRP.Des3d進行LR反應（LR?recombination），構建pRP.EX3d-K14>mVEGF164>hGH；

C、陽性克隆測序確認后，線性化后回收相應片段，對受精卵雄原核進行顯微注射，制備轉基因小鼠并逐步進行繁殖純化。

所述的一種K14-VEGF轉基因小鼠模型的構建方法，具體步驟如下：