[發(fā)明專利]K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠模型及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310006297.8
• 申請日: 2013-01-08
• 公開（公告）號: CN103045606A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡晉紅;李紅;孫軍
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/63;A01K67/027;A61K49/00
• 代理公司: 上海元一成知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31268
• 代理人: 趙青

1.一種K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于，該方法是利用原核顯微注射技術(shù)將包含人類角蛋白14啟動子和鼠編碼基因VEGF-A164插入到FVB鼠基因組內(nèi)，由人類角蛋白14啟動子控制的小鼠VEGF-A164表達(dá)，使轉(zhuǎn)基因鼠表皮基底層過度表達(dá)VEGF-A164。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

A、PCR擴(kuò)增如SEQ?ID?NO:1所示的attB1-mVEGF164-attB2和如SEQ?IDNO:2所示所示的attB2r-hGH-attB3，BP反應(yīng)構(gòu)建中間載體pDown-mVEGF164和pTail-hGH；

B、利用Gateway克隆技術(shù)將pUp-K14、pDown-mVEGF164、pTail-hGH與常規(guī)質(zhì)粒pRP.Des3d進(jìn)行LR反應(yīng)，構(gòu)建pRP.EX3d-K14>mVEGF164>hGH，全序列如SEQ?ID?NO:7所示；

C、陽性克隆測序確認(rèn)后，線性化后回收相應(yīng)片段，對受精卵雄原核進(jìn)行顯微注射，制備轉(zhuǎn)基因小鼠并逐步進(jìn)行繁殖純化。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于，該方法具體步驟如下：

Ⅰ）K14-VEGF164轉(zhuǎn)基因片段的構(gòu)建

ⅰ）pRP.EX3d-K14>mVEGF164>hGH載體的構(gòu)建

ⅱ）PCR擴(kuò)增attB1-mVEGF164-attB2和attB2r-hGH-attB3

設(shè)計(jì)并合成引物如下：

引物名稱????????????????引物序列5’to3’

attB1-mVEGF1????GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCAAG

64??????????????GCGCGCAAGAGAGC（SEQ?ID?NO:3）；

attB2-mVEGF1????GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGGTG

64??????????????TGTCTACAGGAATCCC（SEQ?ID?NO:4）；

attB2r-hGH?????GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGAGGATCCC

???????????????AAGGCCCAACT（SEQ?ID?NO:5）；

attB3-hGH??????GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGAAATGATG

???????????????CAACTTAATTTTATTAGGAC（SEQ?ID?NO:6）；

ⅲ)BP反應(yīng)構(gòu)建中間載體pDown-mVEGF164和pTail-hGH

ⅳ)LR反應(yīng)構(gòu)建pRP.EX3d-K14>mVEGF164>hGH

Ⅱ）PCR菌落篩選陽性克隆

菌落PCR篩選pDown-mVEGF164：PCR產(chǎn)物條帶理論大小1245bp相符的目的條帶；

菌落PCR篩選pTail-hGH圖譜：篩選與PCR產(chǎn)物條帶理論大小2012bp相符的目的條帶；

菌落PCR篩選pRP.EX3d-K14>mVEGF164>hGH：篩選與PCR產(chǎn)物條帶理論大小1034bp相符的目的條帶；

Ⅲ）酶切線性化pRP.EX3d-K14>mVEGF164>hGH

MluⅠ/SalⅠ雙酶切切出的片段理論大小為5267bp和2823bp，陽性克隆測序確認(rèn)后，線性化后回收其中的大片段進(jìn)行轉(zhuǎn)基因小鼠注射；

Ⅳ）通過對FVB鼠受精卵雄原核顯微注射步驟Ⅲ）得到的質(zhì)粒，獲得陽性的K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠模型。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的構(gòu)建方法得到的K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠模型。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠模型，其特征在于，該模型中的小鼠自發(fā)地產(chǎn)生如下的銀屑病表型特征：真皮微血管增生，表皮滲透性增加，角蛋白細(xì)胞異常分化。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠模型在篩選預(yù)防或治療銀屑病藥物中的應(yīng)用。