[發(fā)明專利]一種土壤弓形蟲檢測試劑盒及其制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310003967.0
• 申請日: 2013-01-06
• 公開（公告）號: CN103122382A
• 公開（公告）日: 2013-05-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張德林;王萌;王艷華;孟鵬;葉強(qiáng);蒲元華
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/90
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及檢測土壤中弓形蟲基因組DNA的半套式PCR擴(kuò)增技術(shù)，具體說是一種檢測土壤弓形蟲的快速檢測試劑盒，本發(fā)明包括該試劑盒的制備方法。?

背景技術(shù)

弓形蟲卵囊因其特殊的囊壁結(jié)構(gòu)，對酸、堿、光照等理化因子具有極強(qiáng)的抵抗能力，在土壤中數(shù)月乃至數(shù)年依然具有很強(qiáng)的感染性，土源性弓形蟲病的爆發(fā)在世界上多個國家已有報道，因此土壤被認(rèn)為是弓形蟲病的巨大傳染源。建立土壤弓形蟲檢測方法，定期對土壤的環(huán)境進(jìn)行監(jiān)測，對控制土源性弓形蟲病的傳播極為重要。?

土壤的成分復(fù)雜，且弓形蟲卵囊含量較低，僅依靠物理方法分離蟲體的檢出率低，工作量大，會出現(xiàn)漏檢的情況。而其他目前常用的診斷弓形蟲病的方法包括凝集試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附法只是針對動物血清中弓形蟲抗體進(jìn)行檢測，不能用于土壤的檢測，因此只能利用分子生物學(xué)檢測方法檢測土壤弓形蟲。PCR方法是基于分子生物學(xué)基礎(chǔ)上的靈敏、特異、高效的診斷技術(shù)，能在檢測土壤弓形蟲中起到重要作用。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了克服當(dāng)前土壤弓形蟲診斷技術(shù)中的不足，提供一種基于分子生物學(xué)領(lǐng)域的的高敏感性、高特異性、高效性的土壤弓形蟲檢測試劑盒，同時提供該試劑盒的制備方法。?

本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種土壤弓形蟲檢測試劑盒，包括10×PCR反應(yīng)液、引物混合物、嗜熱DNA聚合酶、牛血清白蛋白、標(biāo)準(zhǔn)陽性模板，其特征在于，所述引物混合物包括：0.2pmol上游引物TX1、10pmol中間引物TX2、10pmol下游引物TX3。?

進(jìn)一步，該土壤弓形蟲檢測試劑盒針對弓形蟲529bp重復(fù)序列基因設(shè)計引物，所述引物序列為：?

上游引物TX1:?5＇-CAGGGAGGAAGACGAAAGTTG-3＇?

中間引物TX2:?5＇-CACAGAAGGGACAGAAGT-3＇?

下游引物TX3:?5＇-CTGTGTCACGTAGACCTAAGG-3＇。?

進(jìn)一步，所述10×PCR反應(yīng)液包括10%?三羥甲基氨基乙烷(Tris-HCl,?pH8.5)、500mM氯化鉀(KCl)、15mM硫酸鎂(MgSO₄)、0.1%吐溫20(Tween?20)和2mM?脫氧核苷酸混合物(dNTPs)。?

本發(fā)明實(shí)施例的另一目的在于提供一種上述土壤弓形蟲檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，該制備方法包括以下步驟：?

⑴?制備10×CRP反應(yīng)液；?

⑵?制備引物混合物；?

⑶?制備標(biāo)準(zhǔn)陽性模板；?

(4)制備牛血清白蛋白溶液。?

進(jìn)一步，制備10×CRP反應(yīng)液：①配置Tris-HCl：?配置濃度為12.11%?Tris，并用HCl調(diào)節(jié)pH8.5，備用；②配置含有終濃度為504.03mM的KCl?、15.12mM的MgSO₄的混合溶液，并加入0.1%?Tween?20和10.08%的Tris-HCl，備用；③將②中配置的溶液與25mM?dNTPs按照體積比為124：1的比例混合；?

進(jìn)一步，制備引物混合物：①?針對弓形蟲529bp重復(fù)序列基因的一段高度保守的區(qū)域設(shè)計引物；②?混合引物中TX1：TX2：TX3為1：50：50按照如上體積比例混勻。?

進(jìn)一步，制備標(biāo)準(zhǔn)陽性模板：①體重為20～25g小鼠每只按1×10⁵～1×10⁶弓形蟲速殖子腹腔接種，經(jīng)3～4日，小鼠出現(xiàn)精神沉郁、不食、被毛粗亂等癥狀時，脫頸致死小白鼠，浸泡于70～75%酒精內(nèi)體表消毒；②?每只小鼠用2毫升PH7.2PBS?緩沖液沖洗腹腔收集蟲體；③提取弓形蟲基因組DNA，此為標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。??

進(jìn)一步，制備牛血清白蛋白溶液：配置含終濃度為20mg/L的牛血清白蛋白溶液。?

本發(fā)明是建立在分子生物學(xué)基礎(chǔ)上，基于弓形蟲高度保守的529bp重復(fù)序列基因，應(yīng)用半套式PCR的方法檢測土壤弓形蟲的試劑盒，具有敏感性高、特異性強(qiáng)、操作簡單等特點(diǎn)，解決了土壤中弓形蟲卵囊檢測的檢出率低，工作量大，操作復(fù)雜及診斷技術(shù)不足等缺陷，可以用于檢測土壤樣本是否含有弓形蟲卵囊并可進(jìn)行土壤弓形蟲分子流行病學(xué)調(diào)查，對周圍環(huán)境進(jìn)行及時監(jiān)測。?

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。?