[發(fā)明專利]一種土壤弓形蟲檢測(cè)試劑盒及其制備方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310003967.0
• 申請(qǐng)日: 2013-01-06
• 公開（公告）號(hào): CN103122382A
• 公開（公告）日: 2013-05-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張德林;王萌;王艷華;孟鵬;葉強(qiáng);蒲元華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/90
• 代理公司: 北京科億知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種土壤弓形蟲檢測(cè)試劑盒，包括10×PCR反應(yīng)液、引物混合物、嗜熱DNA聚合酶、牛血清白蛋白、標(biāo)準(zhǔn)陽性模板，其特征在于，所述引物混合物包括：0.2pmol上游引物TX1、10pmol中間引物TX2、10pmol下游引物TX3。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的土壤弓形蟲檢測(cè)試劑盒，其特征在于，該土壤弓形蟲檢測(cè)試劑盒針對(duì)弓形蟲529bp重復(fù)序列基因設(shè)計(jì)引物，所述引物序列為：

上游引物TX1:?5＇-CAGGGAGGAAGACGAAAGTTG-3＇

中間引物TX2:?5＇-CACAGAAGGGACAGAAGT-3＇

下游引物TX3:?5＇-CTGTGTCACGTAGACCTAAGG-3＇。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的土壤弓形蟲檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述10×PCR反應(yīng)液包括10%?三羥甲基氨基乙烷(Tris-HCl,?pH8.5)、500mM氯化鉀(KCl)、15mM硫酸鎂(MgSO₄)、0.1%吐溫20(Tween?20)和2mM?脫氧核苷酸混合物(dNTPs)。

4.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述土壤弓形蟲檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于，該制備方法包括以下步驟：

⑴?制備10×CRP反應(yīng)液；

⑵?制備引物混合物；

⑶?制備標(biāo)準(zhǔn)陽性模板；

(4)制備牛血清白蛋白溶液。?

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述土壤弓形蟲檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于，

制備10×CRP反應(yīng)液：①配置Tris-HCl：?配置濃度為12.11%?Tris，并用HCl調(diào)節(jié)pH8.5，備用；②配置含有終濃度為504.03mM的KCl?、15.12mM的MgSO₄的混合溶液，并加入0.1%?Tween?20和10.08%的Tris-HCl，備用；③將②中配置的溶液與25mM?dNTPs按照體積比為124：1的比例混合。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述土壤弓形蟲檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于，

制備引物混合物：①?針對(duì)弓形蟲529bp重復(fù)序列基因的一段高度保守的區(qū)域設(shè)計(jì)引物；②?混合引物中TX1：TX2：TX3為1：50：50按照如上體積比例混勻。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述土壤弓形蟲檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于，

制備標(biāo)準(zhǔn)陽性模板：①體重為20～25g小鼠每只按1×10⁵～1×10⁶弓形蟲速殖子腹腔接種，經(jīng)3～4日，小鼠出現(xiàn)精神沉郁、不食、被毛粗亂等癥狀時(shí)，脫頸致死小白鼠，浸泡于70～75%酒精內(nèi)體表消毒；②?每只小鼠用2毫升PH7.2PBS?緩沖液沖洗腹腔收集蟲體；③提取弓形蟲基因組DNA，此為標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。?

8.根據(jù)權(quán)利要求4所述土壤弓形蟲檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于，制備牛血清白蛋白溶液：配置含終濃度為20mg/L的牛血清白蛋白溶液。?