[發明專利]一種釀酒酵母整合型表達載體

有效

• 申請號: 201310003066.1
• 申請日: 2013-01-05
• 公開（公告）號: CN103911371A
• 公開（公告）日: 2014-07-09
• 發明（設計）人: 賀鵬;張新杰;陶勇
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/81;C12R1/865
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及一種釀酒酵母整合型表達載體。

背景技術

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，又稱面包酵母或者出芽酵母。釀酒酵母是與人類關系最密切的一種酵母。釀酒酵母是制作面包和饅頭等食品及釀酒的傳統微生物，是迄今為止最具生物安全性的微生物。同時，在現代分子和細胞生物學中，釀酒酵母被用作真核模式生物，其作用相當于原核的模式生物大腸桿菌。釀酒酵母是發酵中最常用的生物種類。

釀酒酵母的細胞為球形或者卵形，直徑5–10μm。其繁殖的方法為出芽生殖。

釀酒酵母是現代工業生物技術、保健品行業和醫用生物技術中常用的微生物。由于釀酒酵母具有優良的發酵性能，如良好的魯棒性、快速的細胞繁殖性、生產過程中耐受雜菌污染等特性，在工業生物技術中常被用作代謝工程途徑改造的出發生物，經各種代謝通路途徑改造后的釀酒酵母工程菌被用于大宗化學品和精細化工的生產，如燃料乙醇、麥角固醇等。另外，由于釀酒酵母屬于真核生物且具有高生物安全性，在醫用生物技術領域和保健品行業也有廣泛應用，如乙肝疫苗的生產，功能保健酵母的開發等。釀酒酵母表達載體是上述應用和研究不可缺少的工具，各種類型表達載體的構建工作越來越受到人們的重視。

釀酒酵母的表達載體通常為質粒型表達載體。常用的質粒型表達載體屬于大腸桿菌-釀酒酵母穿梭載體，操作時會將大腸桿菌的復制起始點和原核篩選標記（如氨芐青霉素抗性基因）帶入釀酒酵母細胞中，存在隱性的生物安全問題。如果使用體內組裝技術將質粒型表達載體轉入釀酒酵母，雖然能去除原核生物的DNA原件，但增加了操作的復雜程度。除此之外，用質粒型表達載體構建工程菌存在質粒易丟失的問題，導致工程菌生產性能的不穩定。

發明內容

本發明的目的是提供一種釀酒酵母整合型表達載體。

本發明提供了一種雙鏈DNA片段（真核元件組），自上游至下游依次包括如下元件：釀酒酵母染色體上游同源臂、真核啟動子、釀酒酵母的IRES序列、真核篩選基因、真核轉錄終止序列和釀酒酵母染色體下游同源臂。

所述釀酒酵母的IRES序列為釀酒酵母中具有內部核糖體進入位點并具有啟動翻譯功能的DNA序列。所述釀酒酵母的IRES序列具體可如序列表的序列1自5’末端第2312至2659位核苷酸所示。

所述真核啟動子可為酵母的啟動子，具體可為釀酒酵母的啟動子。所述釀酒酵母的啟動子具體可為釀酒酵母的ILV5基因啟動子、釀酒酵母的TDH3基因啟動子或釀酒酵母的ADH2基因啟動子。所述釀酒酵母的ILV5基因啟動子具體可如序列表的序列1自5’末端第1014至1567位核苷酸所示。所述釀酒酵母的TDH3基因啟動子具體可如序列表的序列2所示。所述釀酒酵母的ADH2基因啟動子具體可如序列表的序列3所示。

所述真核轉錄終止序列可為酵母的轉錄終止序列，具體可為釀酒酵母的轉錄終止序列。所述釀酒酵母的轉錄終止序列可為釀酒酵母的URA3基因轉錄終止序列。所述釀酒酵母的URA3基因轉錄終止序列具體可如序列表的序列1自5’末端第3477至3551位核苷酸所示。

所述釀酒酵母染色體上游同源臂，可為釀酒酵母染色體上的18SrDNA的上游同源臂，具體可如序列表的序列1自5’末端第675至1007位核苷酸所示。所述釀酒酵母染色體下游同源臂，可為釀酒酵母染色體上的18SrDNA的下游同源臂，具體可如序列表的序列1自5’末端第3558至3921位核苷酸所示。

所述真核篩選基因可為營養缺陷型選擇標記基因或抗生素選擇標記基因，具體可為釀酒酵母的URA3基因。所述釀酒酵母的URA3基因具體可如序列表的序列1自5’末端第2673至3476位核苷酸所示。所述釀酒酵母的URA3基因具體可如序列表的序列1自5’末端第2673至3473位核苷酸所示。

本發明還保護一種具有所述真核元件組的質粒（釀酒酵母整合型表達載體）。

所述釀酒酵母整合型表達載體還包括原核元件組；所述原核元件組自上游至下游依次包括如下組件：原核復制起點和原核篩選基因。

所述的原核復制起點具體可為pMB1的復制起始點。

所述的原核篩選基因具體可為氨芐青霉素抗性基因。

所述釀酒酵母整合型表達載體具體可為將序列表的序列1所示的質粒去除序列1自5’末端第1580至2296位核苷酸所示DNA片段后得到的質粒。

所述真核元件組或所述釀酒酵母整合型表達載體可用于制備蛋白。