[發明專利]一種重組豬釉原蛋白及其制備方法

無效

• 申請號: 201310002602.6
• 申請日: 2013-01-05
• 公開（公告）號: CN103014050A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 束蓉;程嵐;李希庭;林智愷;宋忠臣
• 申請（專利權）人: 上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C07K14/47;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 上海申新律師事務所 31272
• 代理人: 劉懿

技術領域

本發明涉及一種蛋白，尤其涉及一種重組豬釉原蛋白及其制備方法。

背景技術

釉基質蛋白（enamel?matrix?proteins，EMPs）是牙齒發育到鐘狀期，由內釉上皮細胞分化而來的成釉細胞合成和分泌一系列細胞外基質蛋白。自1975年首次提出來自赫特威氏上皮根鞘的釉質相關蛋白可以誘導牙根部無細胞性牙骨質形成以后，體外實驗和臨床治療廣泛證實EMPs能有效促進牙周韌帶、牙骨質、牙槽骨再生，形成類似正常的牙周組織的排列，達到真正的牙周再生。發育中EMPs最主要的成分——釉原蛋白(amelogenin，Am)，也是EMPs中促進牙周再生的主要活性成分。但Am的組成不是單一的，至少有9種成分，分子量范圍5～27kD。目前廣泛應用于牙周再生的基礎研究和臨床應用的EMPs基本為提取的豬釉基質蛋白，其主要的成分是分子量為20kD、13kD、11kD的Am。?

提取的豬釉基質蛋白主要是幾種釉原蛋白的混合成分，其提取效率及組分穩定性影響到蛋白的功能。其次提取的豬EMPs是異源性蛋白，可能存在免疫原性的問題。目前唯一的釉基質蛋白市售商品——Emdogain?的有效成分也是從豬牙胚組織中提取的釉原蛋白的衍生物。其完全依賴進口，售價昂貴，用于基礎研究和臨床治療所需成本較高。?????

目前國內尚未見有人工合成的單一組分的豬釉原蛋白（pAm）。Am是成釉細胞中Am基因的表達產物。豬有兩個Am基因，分別定位于X染色體和Y染色體上。逆轉錄PCR證實主要的轉錄本來自于X染色體，Y染色體上的釉原蛋白基因也可轉錄，約占總轉錄本的10％。豬Am基因至少包括7個外顯子，存在至少有9種選擇剪切的方式，編碼的九種不同Am在組織中的含量并不相等。剪切去掉外顯子4是最常見的一種剪切方式，由它編碼的Am在發育的釉質中最多見。研究證實成熟的豬Am的主要成分是X染色體上Am基因的翻譯產物——由175個氨基酸殘基組成的Mr1.96×10⁴蛋白。

發明內容

本發明的目的在于提供一種重組豬釉原蛋白及其制備方法，以及含有全長豬釉原蛋白基因的重組原核表達載體和由該重組原核表達載體轉化的大腸桿菌菌株。

本發明提供了一種重組豬釉原蛋白的制備方法，包括以下步驟：

步驟1，合成全長豬釉原蛋白基因；

步驟2，構建含有上述基因的重組原核表達質粒PGEX4T1-pAm；

步驟3，將步驟2獲得的重組原核表達質粒PGEX4T1-pAm轉化菌株E.coli.?BL21；

步驟4，誘導步驟3獲得的重組菌株表達融合蛋白GST-pAm；

步驟5，切除步驟4獲得的融合蛋白GST-pAm的GST標簽蛋白，獲得重組豬釉原蛋白pAm。

其中，步驟1中所述全長豬釉原蛋白基因的堿基序列如SEQ?ID?NO.1所示。

優選地，在步驟2中，構建重組原核表達質粒PGEX4T1-pAm采用內切酶ECoRⅠ和SalⅠ，酶切引物分別為：

5’-CCGGAATTCATGCCTCTACCACCTCATCCTG-3’和

5’-ACGCGTCGACTTAATCCACTTCCTCCCG?CTTG-3’。

優選地，步驟4中，通過異丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）誘導步驟3獲得的重組菌株表達融合蛋白GST-pAm。

優選地，步驟5為：純化步驟4獲得的融合蛋白GST-pAm，切除GST標簽蛋白，獲得純化的重組豬釉原蛋白pAm。

其中，步驟4獲得的融合蛋白GST-pAm通過GST親和層析純化。

優選地，步驟5中切除GST標簽蛋白采用凝血酶。

本發明提供了一種上述方法制備的重組豬釉原蛋白。

所述重組豬釉原蛋白由全長豬釉原蛋白基因（pAm基因）編碼，其中，所述全長豬釉原蛋白基因的堿基序列如SEQ?ID?NO.1所示。

本發明提供了一種含有全長豬釉原蛋白基因的重組原核表達載體，其中，在原核表達質粒PGEX4T1中包含有SEQ?ID?NO.1核苷酸序列。

本發明還提供了一種上述含有全長豬釉原蛋白基因的重組原核表達載體轉化的大腸桿菌菌株。