[發明專利]一種甲醇蛋白發酵濾液再利用的方法

有效

• 申請號: 201310001745.5
• 申請日: 2013-01-05
• 公開（公告）號: CN103045703A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發明（設計）人: 喬國厚;王蘭甫;茍萬曉;胡元森;張寅;曹敏;樊崇;張國杰;許宗浩;衛紅偉;田亞鵬;朱廣有;王霞
• 申請（專利權）人: 義馬煤業集團煤生化高科技工程有限公司
• 主分類號: C12P21/00
• 分類號: C12P21/00;C07K1/14;C12R1/84
• 代理公司: 鄭州天陽專利事務所(普通合伙) 41113
• 代理人: 宋金鼎

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域，特別是一種甲醇蛋白發酵濾液再利用的方法。?

背景技術

應用發酵法生產單細胞蛋白作為飼料，在國內已有很多報導，且有成熟的加工方法，如用假絲酵母、畢赤酵母等作為發酵菌種，以甜菜渣、啤酒糟、柑橘廢渣、糖蜜等一些加工副產品生產的單細胞蛋白。以甲醇為基質通過單細胞生物獲得的單細胞蛋白，目前國內外的生產方法主要有細菌發酵法和酵母菌發酵法，細菌法包括英國的ICI法、德國的Hoechst-Uhde法和瑞典的Norprotein法；酵母菌種生產法包括日本的MGC法、法國的IFP法和美國的Philips?Petroleum法，除ICI法工業化生產外（目前已停產），其他均未工業化，但目前在我國對于單細胞甲醇蛋白飼料的開發還剛剛起步，特別是發酵液的循環再利用問題，目前還沒有任何有關報導，由于發酵在整個單細胞甲醇蛋白工業化生產過程中，是必不可少的步驟，由此而產生的發酵濾液的產出量比較大，大多發酵廠家直接將發酵濾液排掉，不僅給環境造成污染，還使得濾液中部分可再次利用的物質沒有得到有效的利用，造成極大的浪費。?

發明內容

本發明之目的就是提供一種甲醇蛋白發酵濾液再利用的方法，可有效解決單細胞甲醇蛋白工業化生產中發酵液的循環再利用問題。?

本發明解決的技術方案是，將按常規方法或用巴斯德畢赤酵母HGD-01生產甲醇蛋白所得的發酵液靜置，沉降進行離心，過濾，得過濾液和菌體蛋白液，菌體蛋白液中加水，攪拌均勻，噴霧干燥，收集蛋白干粉；過濾液進行回收利用，根據回收利用的次數的不同，每一次回收利用過程中在每升過濾液內添加乙二胺四乙酸（EDTA）的量在0.5?g/L-1.3?g/L內依次遞增，用過濾液和乙二胺四乙酸（EDTA）混配成混合液，根據回收利用的次數的不同，在每一次回收利用過程中，用混合液分別與上述步驟中BSM無機鹽發酵培養基配方中磷酸、無機鹽、微量元素溶液用量的10-20%的磷酸、10-20%的無機鹽、10-20%的微量元素溶液和甘油25kg/m³混配成替代培養基，用替代培養基代替原甲醇蛋白生產過程中使用的發酵培養基，過濾液回收利用一般可進行三次，第三次過濾液不再回收利用；所述的用巴斯德畢赤酵母HGD-01生產甲醇蛋白所得的發酵液的具體步驟是：巴斯德畢赤酵母HGD-01菌株用劃線法接種至YPD試管斜面培養基上，培養得斜面種子，斜面種子接種到搖瓶YPD液體培養基中培養，獲得搖瓶種子；將搖瓶種子接種到YPD液體培養基中，培養得一級種子；一級種子接種到BSM無機鹽發酵培養基中，培養得二級種子；將二級種子接種到發酵培養基中進行發酵，發酵24小時后，開始流加甲醇，控制甲醇濃度，45-50小時后，菌體濕重達到250-300?g/L，OD₆₀₀值達到42～45，即得發酵液。?

本發明大大減少了無機鹽的投入，每次甲醇蛋白的生產，可減少80-90%的無機鹽的使用量，并降低了廢水的排放，節約了水資源，降低了原料成本，且不影響酵母細胞的生長和甲醇蛋白產率，提高了生產效率，產生可觀經濟效益和社會效益。?

具體實施方式

以下結合實際情況對本發明的具體實施方式作詳細說明。?

一種甲醇蛋白發酵濾液再利用的方法，包括如下步驟：?

1）、搖瓶種子培養：

分類命名為巴斯德畢赤酵母（Pichia?pastoris）HGD-01的菌株，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為：CCTCC?NO:M2012342，保藏日期為：2012年9月12日；

在超凈工作臺（儀器型號SW-CJ-1FD）上將甘油管保藏的0.5mL巴斯德畢赤酵母HGD-01的菌株用劃線法接種至YPD試管斜面培養基（試管規格180mm×20mm）上，30℃培養48小時，即得斜面種子；取1支培養好的斜面種子，用10mL無菌水將斜面種子全部沖洗下來，接種到裝有250mL?YPD液體培養基的三角瓶中，瓶口用8層紗布包好，搖床振蕩培養，培養溫度30℃，搖床轉速220rpm，培養約24～30小時后，菌體OD₆₀₀達到3～5，獲得搖瓶種子；所述的YPD試管斜面培養基是由重量百分比計的1%酵母提取物（oxiod公司產品，公知技術，以下同）、2%胰蛋白胨（oxiod公司產品，公知技術，以下同）、2%葡萄糖、2%瓊脂和余量的水混合在一起組成；所述的YPD液體培養基是由重量百分比計的1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖和余量的水混合在一起組成；

2）、一級種子培養：