[發明專利]一種甲醇蛋白發酵濾液再利用的方法有效
| 申請號： | 201310001745.5 | 申請日： | 2013-01-05 |
| 公開（公告）號： | CN103045703A | 公開（公告）日： | 2013-04-17 |
| 發明（設計）人： | 喬國厚;王蘭甫;茍萬曉;胡元森;張寅;曹敏;樊崇;張國杰;許宗浩;衛紅偉;田亞鵬;朱廣有;王霞 | 申請（專利權）人： | 義馬煤業集團煤生化高科技工程有限公司 |
| 主分類號： | C12P21/00 | 分類號： | C12P21/00;C07K1/14;C12R1/84 |
| 代理公司： | 鄭州天陽專利事務所(普通合伙) 41113 | 代理人： | 宋金鼎 |
| 地址： | 472300 河南*** | 國省代碼： | 河南;41 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 甲醇 蛋白 發酵 濾液 再利用 方法 | ||
1.一種甲醇蛋白發酵濾液再利用的方法，其特征在于，包括如下步驟：
1）、搖瓶種子培養：
分類命名為巴斯德畢赤酵母HGD-01的菌株，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為：CCTCC?NO:M2012342；
將甘油管保藏的0.5mL巴斯德畢赤酵母HGD-01的菌株用劃線法接種至YPD試管斜面培養基上，30℃培養48小時，即得斜面種子；取1支培養好的斜面種子，用10mL無菌水將斜面種子全部沖洗下來，接種到裝有250mL?YPD液體培養基的三角瓶中，瓶口用8層紗布包好，搖床振蕩培養，培養溫度30℃，搖床轉速220rpm，培養約24～30小時后，菌體OD600達到3～5，獲得搖瓶種子；所述的YPD試管斜面培養基是由重量百分比計的1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖、2%瓊脂和余量的水混合在一起組成；所述的YPD液體培養基是由重量百分比計的1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖和余量的水混合在一起組成；
2）、一級種子培養：
A、一級種子培養在50L的發酵罐中進行，按步驟1）所述方法在50L罐中配制30L的YPD液體培養基，打開蒸汽閥，使蒸汽進發酵罐夾套層，對YPD液體培養基進行滅菌，滅菌溫度121℃，滅菌時間30min，對YPD液體培養基滅菌的同時，對空氣過濾器和取樣口進行滅菌，通高溫蒸汽滅菌10min，滅菌結束后，打開冷卻水閥門，使冷確水進發酵罐夾套層，對培養基進行降溫，當培養基溫度降至30℃時，開始接種；
B、將搖瓶種子1000mL接種到50L發酵罐內的YPD液體培養基中，溫度28～30℃，轉速150rpm，溶氧40%～50%，培養20～24h后，得一級種子；
3）、二級種子培養：
將3m3的BSM無機鹽發酵培養基放入5m3發酵罐中，用2）A步驟中對YPD液體培養基相同的滅菌方法對BSM無機鹽發酵培養基進行滅菌，滅菌完成后，用質量濃度為35%的氨水調BSM無機鹽發酵培養基pH值至4.8～5.0，然后將30L一級種子通過壓力管道接種到5m3發酵罐內pH值為4.8～5.0的BSM無機鹽發酵培養基中，接種時罐壓為0.05-0.10MPa，培養時，培養溫度30～32℃，通風比1：1~1.5?vvm，罐壓0.05MPa，pH5.0～5.5，培養24~30h，得二級種子；所述的BSM無機鹽發酵培養基為：質量濃度為85%磷酸25kg/m3、磷酸氫二鉀0.5kg/m3、氯化銨0.3kg/m3、二水硫酸鈣0.2kg/m3、氯化鈉0.5kg/m3、硫酸鉀3kg/m3、七水硫酸鎂2kg/m3、甘油25kg/m3和微量元素溶液4L/m3加水制成，也就是說BSM無機鹽發酵培養基為：質量濃度為85%磷酸25kg、磷酸氫二鉀0.5kg、氯化銨0.3kg、二水硫酸鈣0.2kg、氯化鈉0.5kg、硫酸鉀3kg、七水硫酸鎂2kg、甘油25kg和微量元素溶液4L加水至1m3；所述的微量元素溶液為：五水硫酸銅1.5g/L、碘化鉀0.02g/L、一水硫酸錳0.5g/L、二水鉬酸鈉0.2g/L、硼酸0.02g/L、六水合氯化鈷0.3g/L、氯化鋅20g/L、七水合硫酸亞鐵19g/L、質量濃度98%的濃硫酸4mL/L、生物素0.2g/L、對氨基苯甲酸0.05g/L和泛酸鈣0.05g/L加水制成，也就是說微量元素溶液為：五水硫酸銅1.5g、碘化鉀0.02g、一水硫酸錳0.5g、二水鉬酸鈉0.2g、硼酸0.02g、六水合氯化鈷0.3g、氯化鋅20g、七水合硫酸亞鐵19g、質量濃度98%的濃硫酸4mL、生物素0.2g、對氨基苯甲酸0.05g和泛酸鈣0.05g加水至1L；
4）、高密度發酵：
在50m3發酵罐中加入BSM無機鹽發酵培養基30m3做為發酵培養基，用160℃以上的蒸汽進行滅菌，同時對與50m3發酵罐相連的管道進行滅菌，滅菌結束后，將發酵培養基溫度降至30～35℃，用質量濃度為35%的氨水調發酵培養基pH至4.5～5.0，然后將二級種子3m3接種到50m3發酵罐內pH為4.5～5.0的發酵培養基中進行發酵，發酵溫度為30～32℃，通氣量1.5～2vv/m，攪拌轉速80-200rpm，24小時后，培養基中甘油耗盡，溶氧開始上升，開始流加甲醇，用甲醇檢測儀器在線監測甲醇濃度，使甲醇濃度控制在0.8%～1.2%，45-50小時后，菌體濕重達到250-300?g/L，OD600值達到42～45，此時發酵結束，即得發酵液；?
5）、過濾液的收集：
發酵液靜置，沉降4～8小時，上層發酵液用臥螺離心機進行離心，離心機轉速3000轉/分鐘，進料量5m3/h，離心清液再用板框過濾機過濾，過濾面積20m2，過濾流速1.5?m3/h，過濾得第一次過濾液和菌餅，將菌餅投入到5m3發酵儲罐中，加入菌餅體積量1/5的清水，攪拌均勻，進入噴霧干燥機，調節進風口溫度至140～160℃、出口溫度至65-80℃，調節進料流量為1噸/小時，噴霧干燥，收集蛋白干粉；
6）、第一次發酵濾液的收集
第一次過濾液中添加乙二胺四乙酸，每升第一次過濾液中EDTA添加量為0.5g/L，得第一混合液，再用質量濃度為85%的磷酸和質量濃度為35%的氨水調第一混合液pH值到5.5～6.0，得第一次發酵濾液；
7）、第二次發酵濾液的收集
分別取上述3）步驟中BSM無機鹽發酵培養基配方中磷酸、無機鹽及微量元素溶液用量10%的磷酸、10%的無機鹽、10%的微量元素溶液、甘油25kg/m3和第一次發酵濾液20m3混合，加水至30m3，得第一替代培養基，備用；所述的無機鹽為磷酸氫二鉀0.5kg/m3、氯化銨0.3kg/m3、二水硫酸鈣0.2kg/m3、氯化鈉0.5kg/m3、硫酸鉀3kg/m3和七水硫酸鎂2kg/m3；再按上述1）、2）、3）、4）、5）、步驟中的方法和用量再次收集第二次過濾液，其中，在收集第二次過濾液的過程中，將上述第4）步驟中所用的發酵培養基替換成第一替代培養基，收集得第二次過濾液和蛋白干粉，第二次過濾液添加乙二胺四乙酸進行回收利用，即每升第二次過濾液中EDTA添加量為0.9g/L，得第二混合液，再用質量濃度為85%的磷酸和質量濃度為35%的氨水調第二混合液pH值到5.5～6.0，得第二次發酵濾液；
8）、第三次發酵濾液的收集
分別取上述3）步驟中BSM無機鹽發酵培養基配方中磷酸、無機鹽及微量元素溶液用量15%的磷酸、15%的無機鹽、15%的微量元素溶液、甘油25kg/m3和第二次發酵濾液20m3混合，加水至30m3，得第二替代培養基，備用，所述的無機鹽為磷酸氫二鉀0.5kg/m3、氯化銨0.3kg/m3、二水硫酸鈣0.2kg/m3、氯化鈉0.5kg/m3、硫酸鉀3kg/m3、七水硫酸鎂2kg/m3；再按上述1）、2）、3）、4）、5）、步驟中的方法和用量再次收集第三次過濾液，其中，收集第三次過濾液的過程中，將上述第4）步驟中所用的發酵培養基替換成第二替代培養基，收集得第三次過濾液和蛋白干粉，第三次過濾液中添加乙二胺四乙酸進行回收利用，即每升第三次過濾液中EDTA添加量為1.3g/L，得第三混合液，再用質量濃度為85%的磷酸和質量濃度為35%的氨水調第三混合液，pH值到5.5～6.0，得第三次發酵濾液；
9）、第三次發酵濾液的再利用
分別取上述3）步驟中BSM無機鹽發酵培養基配方中磷酸、無機鹽及微量元素溶液用量20%的磷酸、20%的無機鹽、20%的微量元素溶液、甘油25kg/m3和第三次發酵濾液20m3混合，加水至30m3，得第三替代培養基，備用，所述的無機鹽為磷酸氫二鉀0.5kg/m3、氯化銨0.3kg/m3、二水硫酸鈣0.2kg/m3、氯化鈉0.5kg/m3、硫酸鉀3kg/m3、七水硫酸鎂2kg/m3；再按上述1）、2）、3）、4）、5）、步驟中的方法和用量再次制備蛋白干粉，其中，此次制備蛋白干粉過程時，將上述第4）步驟中所用的發酵培養基替換成第三替代培養基，制備得第四次過濾液和蛋白干粉，第四次過濾液排放到污水處理車間。
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