[發(fā)明專利]一種大鯢虹彩病毒LAMP檢測試劑盒及檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310000433.2
• 申請日: 2013-01-04
• 公開（公告）號: CN103014181A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曾令兵;孟彥;徐進(jìn);張輝;周勇;范玉頂
• 申請（專利權(quán)）人: 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于魚類病毒檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大鯢虹彩病毒LAMP檢測試劑盒，還涉及一種利用大鯢虹彩病毒LAMP檢測試劑盒檢測大鯢虹彩病毒的方法。

背景技術(shù)

大鯢(Andrias?davidianus)俗稱娃娃魚，屬兩棲綱、有尾目、隱鰓鯢科、大鯢屬，1988年被列為國家二級保護(hù)動(dòng)物，2007年《瀕危野生動(dòng)植物物種國際貿(mào)易公約》（CITEJ）第14屆締約國大會被列為Ⅰ類瀕危物種。大鯢不僅具有一定的藥用和科研價(jià)值，而且還可以作為觀賞動(dòng)物和食用佳肴。20世紀(jì)80年代以來，我國各地陸續(xù)進(jìn)行了大鯢的人工養(yǎng)殖和繁殖，目前已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖中高效養(yǎng)殖的優(yōu)良品種之一。然而隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，大鯢病害問題日益突出，尤其是近年來暴發(fā)的大鯢病毒性出血病，給大鯢養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約了其健康養(yǎng)殖的發(fā)展。

為了及早發(fā)現(xiàn)和確診大鯢病毒性出血病病原，大鯢虹彩病毒(Giant?salamander?iridovirus，GSIV)，有必要建立一種準(zhǔn)確、快速、靈敏的檢測方法，為疾病的診斷與防控提供技術(shù)手段，也為大鯢養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展提供技術(shù)保障。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated?isothermal?amplification,LAMP)技術(shù)是Notomi等于2000年報(bào)道的一種新型等溫核酸擴(kuò)增方法（國際專利公開號WO00/28082），針對靶基因的6個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)4條LAMP引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst?DNA聚合酶)，在恒溫條件下快速、高效、高特異、高靈敏地?cái)U(kuò)增靶序列，適合于現(xiàn)場和實(shí)驗(yàn)條件較簡單的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行快捷檢測。引入一對環(huán)狀引物的改進(jìn)方法，進(jìn)一步縮短了反應(yīng)時(shí)間。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的是在于提供了一種大鯢虹彩病毒LAMP檢測試劑盒，根據(jù)GenBank公布的GSIV毒株的MCP基因編碼區(qū)序列(JN615141.1)，應(yīng)用PrimerExplorer?V4（http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html）在線軟件設(shè)計(jì)特異性引物，利用LAMP技術(shù)擴(kuò)增靶基因的特定區(qū)域，從分子水平對大鯢虹彩病毒進(jìn)行快速檢測，具有簡便、快速、高特異性和靈敏性的特點(diǎn)。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種利用大鯢虹彩病毒LAMP檢測試劑盒檢測大鯢虹彩病毒的方法，本方法僅需一個(gè)水浴鍋或金屬浴即可在2小時(shí)內(nèi)準(zhǔn)確檢測出樣品中的GSIV，能檢測GSIV感染的病魚組織，能檢測GSIV感染的細(xì)胞（例如EPC細(xì)胞），非常適用于GSIV的現(xiàn)場快速檢測。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種大鯢虹彩病毒LAMP檢測試劑盒，包括以下成分：

該試劑盒包括以下成分：10×ThermoPol?Reaction?Buffer；Bst?DNA聚合酶（NEB）；dNTPs；外引物F3和B3、內(nèi)引物FIP和BIP、Betaine（Sigma），MgCl₂，1000×SYBR?Green?I（Invitrogen）。

F3：5，-CGACTTGGCCACTTATGACA-3，；

B3：5，-TTGACCTCGGGGGTCTTG-3，；

FIP：5，-GTGAACCACCCCACGGGGTAAAAACAATGTACGGGGGTTCAGAT-3，；

BIP：5，-AAGATGTCGGGTAACCCGGCTTAAAAACCAGGCGTTGAGGATGT-3，。

一種利用大鯢虹彩病毒LAMP檢測試劑盒檢測大鯢虹彩病毒的方法，其步驟是：

1、病毒DNA的獲取：

采用試劑或Viral?DNA?Kit試劑盒等提取樣本總DNA。

2、LAMP擴(kuò)增：

采用25μl反應(yīng)體系，包括：內(nèi)引物FIP和BIP各0.8μM，外引物F3和B3各0.1μM，dNTPs1mM，Betaine0.5M，MgCl₂2-10mM，Bst?DNA聚合酶8U，模板DNA5μl，10×ThermoPol?Reaction?Buffer2.5μl，余量去離子水補(bǔ)足。選擇55-65℃的溫度范圍和30－120分鐘的時(shí)間范圍進(jìn)行LAMP反應(yīng)之后，80℃滅活2分鐘。

3、檢測結(jié)果判定，可用下述三種方法之一進(jìn)行結(jié)果的判定：

1）發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，從dNTPs析出的焦磷酸根離子和反應(yīng)液中的鎂離子形成白色焦磷酸鎂沉淀，通過肉眼判斷：檢測管出現(xiàn)明顯渾濁為陽性，未見渾濁為陰性。