[發(fā)明專利]一種大鯢虹彩病毒LAMP檢測試劑盒及檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310000433.2
• 申請日: 2013-01-04
• 公開（公告）號: CN103014181A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曾令兵;孟彥;徐進(jìn);張輝;周勇;范玉頂
• 申請（專利權(quán)）人: 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 王敏鋒

1.一種大鯢虹彩病毒LAMP檢測試劑盒，其特征在于，包括以下成分：

該試劑盒包括以下成分：10×ThermoPol?Reaction?緩沖液；Bst?DNA聚合酶；dNTPs；外引物F3和B3、內(nèi)引物FIP和BIP、Betaine，MgCl₂，1000×SYBR?Green?I;

F3：5^，-?CGACTTGGCCACTTATGACA?-?3^，；

B3：5^，-?TTGACCTCGGGGGTCTTG?-3^，；

FIP：5^，-GTGAACCACCCCACGGGGTAAAAACAATGTACGGGGGTTCAGAT?-?3^，；

BIP：5^，-AAGATGTCGGGTAACCCGGCTTAAAAACCAGGCGTTGAGGATGT?-?3^，。

2.利用權(quán)利要求1所述的一種大鯢虹彩病毒LAMP檢測試劑盒檢測大鯢虹彩病毒的方法，其步驟是：

1）、病毒DNA的獲取:

采用DNAzol^?試劑或Viral?DNA?Kit試劑盒等提取樣本總DNA；

2）、LAMP擴(kuò)增:

采用25μl反應(yīng)體系：內(nèi)引物FIP和BIP各0.8μM，外引物F3和B3各0.1μM，dNTPs1mM，Betaine0.5M，MgCl_2?2-10mM，Bst?DNA聚合酶8U，模板DNA5μl，10×ThermoPol?Reaction?Buffer?2.5μl，去離子水補(bǔ)足至25μl，選擇55-65℃和30-120分鐘進(jìn)行LAMP反應(yīng)之后，80℃滅活2分鐘；

3）、檢測結(jié)果判定，采用下述三種方式之一：

A、發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)時，從dNTPs析出的焦磷酸根離子和反應(yīng)液中的鎂離子形成白色焦磷酸鎂沉淀，通過肉眼判斷：檢測管出現(xiàn)明顯渾濁為陽性，未見渾濁為陰性；

B、每25μl體系的反應(yīng)管加1000×SYBR?Green?I?1-2μl，1-5?min觀察結(jié)果，反應(yīng)液變綠為陽性，保持橙色為陰性；

C、取擴(kuò)增產(chǎn)物，用2%(?w/v)的瓊脂糖凝膠電泳后，置于凝膠成像系統(tǒng)中成像，電泳圖片顯示LAMP特征性梯狀條帶，則結(jié)果為陽性；如無任何條帶，則結(jié)果為陰性。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種大鯢虹彩病毒LAMP檢測試劑盒檢測大鯢虹彩病毒的方法，其特征在于：MgCl₂?的濃度為8mM。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種大鯢虹彩病毒LAMP檢測試劑盒檢測大鯢虹彩病毒的方法，其特征在于：反應(yīng)溫度為65℃。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種大鯢虹彩病毒LAMP檢測試劑盒檢測大鯢虹彩病毒的方法，其特征在于：模板DNA在95℃5分鐘后置于冰浴中的預(yù)處理。