[發明專利]蔥葉凝集素重組蛋白、其編碼多核苷酸、引物及其制備方法

有效

• 申請號: 201280070840.4
• 申請日: 2012-12-17
• 公開（公告）號: CN104302769A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發明（設計）人: 普拉丹優納·庫馬爾·辛格;普里提·拉伊;拉赫爾·辛格;桑托什·庫馬爾·烏帕德亞;沙拉德·紹拉巴;哈爾帕·辛格;普拉韋恩·錢德拉·維爾馬;錢德拉謝卡爾·克里希納帕;拉凱什·圖利
• 申請（專利權）人: 科學與工業研究會
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/11;C12N15/70;C07K14/42;A01P7/04
• 代理公司: 北京同立鈞成知識產權代理有限公司 11205
• 代理人: 劉洋

1.一組用于擴增Seq?ID?No?1的蔥葉凝集素(afal)基因的基因特異性引物GSP?1和GSP?2，其特征在于，所述引物分別具有如下所示的Seq?ID?No.5和Seq?ID?No.6的序列：

GSP1(5’-ATGGACAGTACTCCATCTCCTAAAC-3’)

GSP2(5’-TTAGCCCCTTGGCCTCCTGCA-3’)。

2.一組用于擴增由Seq?ID?No?2表示的成熟afal基因的基因特異性引物GSP?3和GSP?4，其特征在于，所述引物分別具有如下所示的Seq?ID?No.7和Seq?ID?No.8的序列：

GSP?3(5’-AGAAACGTATTGGTGAACAACG-3’)

GSP?4(5’-TTATCTTCTGTAGGTACCAGTAGAC-3’)。

3.一種通過使用權利要求1和2所述的引物擴增AFAL基因來制備蔥葉凝集素(AFAL)重組蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

a)從所述蔥葉中提取總RNA，

b)由從所述蔥葉中提取的總RNA合成cDNA，

c)由cDNA的5’-和3’-RACE片段設計引物GSP1和GSP2，以克隆全長蛋白編碼DNA，設計引物GSP3和GSP4用于克隆編碼AFAL蛋白的成熟多肽的DNA，

d)在大腸桿菌SUMO表達載體中表達編碼成熟AFAL的DNA，其中SUMO肽在N-末端與AFAL融合并通過T7啟動子在大腸桿菌中表達，從而得到所需的AFAL重組蛋白。

4.由Seq?ID?No?1表示的核酸序列，其通過權利要求1和3所述的方法得到，其特征在于，Seq?ID?No?1包括1至585個核苷酸或與其互補的序列，用于編碼全長蔥葉凝集素多肽，其中核苷酸序列583-585是終止密碼子。

5.由Seq?ID?No?2表示的核酸序列，其使用權利要求1-4所述的全長AFAL編碼基因作為模板，利用引物GSP3和GSP?4進行PCR擴增得到，其特征在于，Seq?ID?2是Seq?ID?1的一部分，具有85至414核苷酸序列。

6.Seq?ID?No?3的多肽，其通過權利要求1-5所述的核酸Seq?ID?No?1編碼，其特征在于，所述多肽是長度為194個氨基酸殘基的蔥葉凝集素(AFAL)蛋白前體。

7.Seq?ID?No?4的多肽，其通過權利要求5所述的核酸Seq?ID?No?2編碼，其特征在于，所述多肽是長度為110個氨基酸殘基的蔥葉凝集素(AFAL)重組蛋白成熟肽，分子量為～12kDa。

8.根據權利要求7所述的重組蛋白，其特征在于，所述多肽的最小血細胞凝集素值在8μg/ml的范圍內。

9.根據權利要求7所述的重組蛋白，其特征在于，所述蛋白表現出殺蟲活性、殺真菌活性、殺細菌活性和抗增殖活性。

10.根據權利要求7所述的重組蛋白，其特征在于，所述蛋白對棉蚜、煙粉虱、棉鈴蟲(Helicoverpa?armigera)和斜紋夜蛾(Spodoptera?litura)或任何其他作物昆蟲，例如鱗翅目昆蟲、同翅目昆蟲、鞘翅目昆蟲、雙翅目昆蟲及其他昆蟲表現出殺蟲活性。

11.根據權利要求7所述的重組蛋白，其特征在于，所述蛋白在大腸桿菌中表達，并可在任何表達系統中表達，例如假單胞菌屬(Pseudomonas)，或在酵母表達系統中表達，例如人畢赤酵母(Pichia?pestoris)或其他酵母。

12.基本如文中參照實施例和說明書附圖所述的蔥葉凝集素(AFAL)重組蛋白、其編碼多核苷酸、引物，及其制備方法。