[發明專利]修飾的腸激酶輕鏈

有效

• 申請號: 201280063896.7
• 申請日: 2012-12-20
• 公開（公告）號: CN103998606B
• 公開（公告）日: 2018-04-17
• 發明（設計）人: H.F.維迪克;張旭家;劉云;佟崴嵬
• 申請（專利權）人: 諾沃—諾迪斯克有限公司
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64;C12N15/62
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司72001
• 代理人: 杜艷玲,權陸軍

技術領域

本發明涉及新的哺乳動物腸激酶類似物，制備這種物質的方法和所述哺乳動物腸激酶類似物用于切割具有腸激酶切割位點的蛋白質中的用途。

通過引用對序列表的合并

序列表，標題為“序列表”，為10 kb，創建于2012年12月17日，通過引用合并入本文。

背景

絲氨酸蛋白酶腸激酶(enterokinase)(簡稱腸激酶或EK)，也被稱為腸肽酶(enteropeptidase)，是異二聚糖蛋白，一種催化胰蛋白酶原轉變為活性胰蛋白酶的哺乳動物酶。腸激酶優先選擇底物序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys ((Asp)₄-Lys, DDDDK)，其中它選擇性地在賴氨酸之后切割。從牛十二指腸粘膜中分離的腸激酶展示150,000的分子量(MW)和35%的糖含量(carbohydrate content)。該酶由重鏈(MW~115,000)和二硫鍵連接的輕鏈(MW~35,000)組成(Liepnieks 等, J. Biol. Chem., 254(5): 1677-1683 (1979))。重鏈的功能是將酶固定在粘膜的膜上。輕鏈充當催化亞基。

在大腸桿菌(E.coli)中，許多哺乳動物蛋白被表達為融合蛋白，其必須被切割以釋放成熟的活性蛋白。為了該目的需要有加工酶，優選直接在連接處切割而在產物上不留下額外氨基酸的加工酶。腸激酶是這樣的酶，而且已經進行了許多努力以在大腸桿菌中確定重組方法以獲得腸激酶或腸激酶類似物。但是，到目前為止結果仍然相當貧乏：可獲得的商業產品價格昂貴且特異性活性較低，這是由于沉淀的EK的無效復性或可溶的EK的無效分泌造成的。

大腸桿菌中針對可溶性EK產品的方法導致可溶性和不溶性蛋白的混合物，需要2種純化路線，昂貴的親和柱，并且總之產量較低。為了獲得均一的產品，EK必須被產生為包含體形式的不可溶物質。它們易于分離但是難以以令人滿意的產量復性，這是由于蛋白可能聚集。

本發明的目的是獲得具有改進性質的哺乳動物腸激酶類似物。

簡述

本發明涉及在合適位點突變的哺乳動物腸激酶類似物。本發明的腸激酶類似物相對于親本(野生型)哺乳動物腸激酶中氨基酸的一個或多個替換可以例如是疏水氨基酸被親水的、帶電荷的氨基酸替換。

在本發明的一個方面，獲得的牛腸激酶輕鏈類似物包含在位置134和/或135上的至少一個由疏水氨基酸向親水帶電荷氨基酸的替換。在一個方面，根據本發明的牛腸激酶輕鏈類似物進一步包含在位置112上的替換。

本發明還涉及在腸激酶輕鏈類似物的復性過程中獲得提高的溶解性的方法。在一個方面，該方法包括將野生型牛腸激酶輕鏈的一個或多個疏水氨基酸突變為親水氨基酸的步驟，以及任選地將野生型牛腸激酶輕鏈的其它氨基酸進行突變的步驟，其中進行突變的疏水氨基酸位于折疊的野生型牛腸激酶輕鏈的表面上。

在一個方面，本發明提供用于獲得哺乳動物腸激酶類似物的改進的生產方法。另外或者可選地，在第二個方面，本發明提供改進的生產方法，其導致產量提高。

在本發明的一個方面，生產牛腸激酶輕鏈類似物的方法包括以下步驟：

a) 在包含誘導物的生長培養基中培養宿主細胞，其中所述宿主細胞包含編碼腸激酶輕鏈類似物的氨基酸序列的多核苷酸序列；

b) 回收具有包含體形式的腸激酶輕鏈的細胞

c) 溶解并再折疊腸激酶輕鏈類似物；以及

d) 純化腸激酶輕鏈類似物。

在一個方面，本發明提供在細菌或酵母宿主細胞中重組生產肽或蛋白質的方法。在一個方面，所述方法包括：

a) 在酵母或細菌中表達包含要被生產的肽或蛋白質的融合蛋白；

b) 用根據方面1-9任一項的牛腸激酶輕鏈類似物切割所述融合蛋白；以及

c) 分離產生的肽或蛋白。

本發明還可以解決隨著示例性的實施方案的公開將會顯而易見的其它問題。

附圖簡述

圖1：Trx-EK_L (A)和Trx-EK_LM (B)表達對誘導時間的依賴。M：標志物；BI：誘導前；I2, I3, I4和I6分別代表IPTG的誘導時間(小時)；15%凝膠；使用發酵確定成分培養基(Fermentation defined medium, FDM)。

圖2：EK純化的流程圖