[發明專利]用于對抗體的糖基化進行測定的方法

有效

• 申請號: 201280056607.0
• 申請日: 2012-09-13
• 公開（公告）號: CN103959063B
• 公開（公告）日: 2016-11-09
• 發明（設計）人: 德爾菲娜·賈加;哈米德·莫克安娜;斯特凡娜·馬丁內斯;米歇爾·芬克
• 申請（專利權）人: CISBIO生物試驗公司
• 主分類號: G01N33/542
• 分類號: G01N33/542
• 代理公司: 北京信慧永光知識產權代理有限責任公司 11290
• 代理人: 洪俊梅;張淑珍

技術領域

本發明涉及用于對抗體與存在于細胞表面上的可結晶片段Fc的受體(以下稱為“Fc受體”或FcR)的結合進行檢測的方法，并涉及用于對抗體的糖基化水平進行測定的方法。

背景技術

多年來，重組單克隆抗體使得得以發生治療革命。雖然其臨床效力不再需要任何證明，然而對于重組單克隆抗體在患者中的作用方式仍知之甚少。靶向膜抗原的抗體的療效特別涉及募集表達抗體可結晶片段的受體(以下稱為“Fc受體”)的效應細胞。

Fc受體是存在于對免疫系統的功能有貢獻的特定細胞表面上的蛋白，所述細胞特別是NK(“自然殺傷”)細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和肥大細胞。Fc受體的名字來自于它們與抗體的Fc(可結晶片段)區域結合的能力。存在多種類型的Fc受體，根據Fc受體識別的抗體類型將其分類：Fcγ受體(FcγR)與IgG結合；Fcα受體(FcαR)與IgA結合；以及Fcε受體(FcεR)與IgE結合。

Fc受體與抗體的結合觸發多種機制，這取決于表達該受體的細胞的性質。表1為不同Fc受體的細胞分布以及由該受體與抗體結合所觸發的機制的概要。

表1

鑒于Fc受體與抗體結合的相關機制的重要性，在這些受體處于細胞環境中時、特別是在開發用于診斷或治療目的的抗體或Fc片段的情況下，能夠檢測這一結合將是特別有利的。

觸發ADCC機制的治療性抗體目前已在銷售，并適用于治療某些癌癥：這些抗體的Fc片段與存在于NK細胞上的Fc受體結合，而這些抗體的可變域識別存在于腫瘤細胞上的抗原(赫賽汀(Herceptin)：Her2；西妥昔單抗(Cetuximab)：Her1)。這些抗體同時與NK細胞和癌細胞的結合通過ADCC機制的活化顯著導致癌細胞的破壞。

此外，已知抗體Fc片段的糖基化影響這些抗體對于FcR的親和力，因此影響其募集效應細胞的能力。具體而言，在Fc片段的N-聚糖基團水平幾乎不存在或不存在巖藻糖殘基的改進的治療性抗體在低濃度引起強ADCC應答，與其巖藻糖基化的等同物(equivalents)相比具有好得多的效力(Shields等，J?Biol?Chem.2002年7月26日，277(30)：26733-40；Suzuki等，Clin?Cancer?Res.2007年3月15日，13(6)：1875-82)。在這些研究中，通過ELISA(“酶聯免疫吸附分析”的首字母縮略詞)類型的分析或在功能上通過測量ADCC應答，對抗體與FcR的結合進行測量。

一般說來，用于檢測潛在治療性抗體與由完整(intact)細胞表達的Fc受體的結合的方法將是用于開發治療性抗體或者用于研究由Fc受體介導的免疫系統機制的有價值的工具。目前可用于研究抗體與Fc受體的結合的技術相對繁瑣(tedious)。

以這一名稱銷售的系統允許檢測兩個結合伴侶(partner)之間的相互作用，這一系統基于表面等離子共振現象。已將該系統用于研究抗體Fc片段的糖基化對其與FcγRIII受體的結合的影響。該系統需要將Fc受體或待測抗體的Fc域片段固定在微芯片上，以使其能夠生成取決于其表面折射率的信號(Biacore?Journal?Number1，2009，15-17)。該方法具有數個缺陷，尤其是將結合伴侶之一固定在微芯片表面這一關鍵步驟，需要昂貴且滿足一定專業水平的設備，并且事實上該技術不能用于對研究中表達Fc受體的活細胞進行操作。此外，這一方法還不能提供關于測試抗體可能以其細胞構象與抗原結合的信息。

法國專利申請FR2844521描述了一種方法，根據該方法，將抗體與表達CD16受體的細胞在該抗體的抗原存在的情況下接觸，并測量由該細胞產生的至少一種細胞因子，細胞因子量的增加代表所述細胞的活化。該技術不能直接測量抗體與FcR的結合。該技術還需要對上清液進行離心的步驟來檢測由細胞分泌的細胞因子。

歐洲專利申請EP1298219描述了用于對抗體Fc片段對表達FcR的細胞的影響進行測定的方法，該方法包括：將所述抗體固定在固體支持物上，在所述抗體存在的情況下培養表達所述受體的細胞，并測量在所述抗體存在的情況下對FcR的任何影響。在該方法中，也通過檢測由細胞產生的細胞因子，對FcR的活化進行間接測量。該技術具有與申請FR2844521中所描述的技術相同的缺陷，尤其是離心步驟。